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| 山羊草属S基因组与小麦属B/G基因组
RAPD标记和特异DNA片段克隆及研究
刘 旭1 汪瑞琪2 贾继增1 董玉琛1 1 中国农业科学院作物品种资源研究所，北京，100081
2 USDAARSFRRL,Logan,Utah,UT843226300,USA
摘要 本研究利用132个随机引物，对山羊草属和小麦属11个种的DNA进行扩增。对其中特异RAPD扩增产物进行克隆，然后用其做探针与小麦族23个种属DNA的RAPD扩增产物进行Southern杂交。共得到24个特异克隆：其中小麦族共有特异克隆1个，山羊草属和小麦属共有特异克隆2个，S基因组特异克隆2类7个，B/G基因组特异克隆2类6个，S基因组与B/G基因组共有的特异克隆8个。24个特异克隆中有22个测定了序列，其中15个为Fasta数据库里显示未见报导的序列。用这24个特异DNA克隆制成的探针与相应的23个材料经Hind Ⅲ酶切消化的总DNA进行Southern杂交，发现其中7个可做为基因组特异探针。通过对24个特异DNA克隆分析研究表明：①S基因组是由两个基本不同的类型构成的，即拟斯卑尔脱山羊草为一个类型，其余4个S组山羊草为另一类型；因此建议前者基因型符号仍保留为“S”，而其余4个种之间无明显不同，故应把基因组符号统一为“Sl”。②S基因组是小麦B/G基因组的供体，而拟斯卑尔脱山羊草可能是最主要的供体，但并不排除其余S基因组的种参与了B/G基因组形成的可能；研究还表明B基因组与S基因组还是有很大区别的，并已找到了B基因组的特异标记。 关键词 S基因组；B基因组；RAPD；克隆；特异DNA片段
在异源六倍体小麦的起源进化研究中，A基因组和D基因组的来源或供体问题早已解决了，而小麦中B/G基因组的起源或供体在20世纪一直是许多人研究和探索的目标，但时至今日并没有得到解决。 综合半个多世纪的研究，概括起来关于B/G基因组的起源或供体主要有3种看法：①起源于山羊草属Sitopsis组中的某一个种，曾有不同学者在不同年份依据不同事实把5个S基因组的种分别列为B/G基因组的起源或供体种；②可能来源于一个已消失或尚未发现的二倍体山羊草种；③B基因组不是由一个物种进化而来，它是由多个物种相互杂交后形成的。 80年代以来，由于分子生物学技术的迅速发展，分子克隆技术和分子标记技术的完善，人们开始使用新技术、新手段来研究小麦B/G基因组的来源或供体问题。Hassan Mat Daud和J.P.Gustafson［1］从Ae.speltoides中克隆了一个特异DNA片段(pSp89,Ⅺ)，并用其为探针与S基因组的5个种以及小麦中带有AA、AABB、AABBDD基因组的种及带DD基因组的山羊草种进行Southern点杂交，从而认为Ae.speltoides是B基因组的原初供体。另外Talbert等［2］以其克隆的pSe135为探针进行Southern杂交表明Ae.speltoides与其余4个S基因组有明显不同；而AnamthawatJonsson等［3］在Ae.speltoides中克隆了该物种的特异片段。到目前为止，对S基因组通过大量筛选分子标记，进行大量特异DNA片段克隆的工作还尚未展开；在小麦上，已有不少特异DNA片段被克隆出来，但B/G基因组的特异DNA片段至今未见报道。 本试验的目的是利用现代分子标记、分子克隆技术，研究S基因组的遗传多样性，并通过大量筛选山羊草属S基因组和小麦B/G基因组的RAPD标记，对特异DNA片段进行克隆、测序，以研究S基因组和B/G基因组的亲缘关系，为探讨B/G基因组起源或供体提供新的证据。
1 材料与方法 1.1 供试材料
表1 RAPD标记鉴定、克隆及总基因组分析所用材料一览表 Table 1 The materials used in RAPD analysis, cloning and genomic analysis
RAPD标记仅用了Y45，克隆和Southern杂交使用全部5个材料。 RAPD analysis using material on the line, cloning and Southern analysis using material below the line.
供试材料见表1(表1中1、2、6～12编号的材料为中国农科院品资所提供，其余材料为USDA-ARS-FRRL提供)。在RAPD标记 鉴定中所用的为具有山羊草属S、C、U、M基因组的材料和小麦属中具有A、AB、ABD基因组的材料(表1中1～11编号的材料)；在特异DNA克隆后进行Southern杂交中除上述材料外又增加了12份(即全部表1中的材料)。 1.2 研究方法 1.2.1 DNA的提取 幼嫩叶片用液氮研磨，酚-氯仿粗提后用TE溶解，RNA酶处理后，用酚氯仿除去RNA酶，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，干燥后溶于TE中备用。 1.2.2 RAPD扩增 扩增反应体积25ml，含有1×buffer，0.64mmol/l的dNTP，1.2mol/l的primer (Operon Technologies)，3mmol/l的MgCl2，2u/25μl的Stoffel fragment (Perkin Elmer)和1.6ng的模板DNA。扩增反应共40循环，每一个循环变性1min(93℃)，退火1min(35℃)，聚合2min(71℃)。 1.2.3 RAPD产物克隆 采用General ContractorTMDNA 克隆系统(5Prime-3Prime,1ns)。用抗药性和X-gal显色双重检测来筛选；用碱裂解法提取质粒；EcoR I内切；检测插入片段的有无及大小。 1.2.4 RAPD产物的Southern杂交 RAPD产物用2%琼脂糖凝胶电泳后，用碱法转移到带正电的纤维素膜上并固定；用Digoxigenin-d UTP标记克隆片段；膜、探针与杂交液65℃下震荡过夜；用Antidigoxienin-AP Feb fragment及NBT BCIP显色。 1.2.5 序列分析 分别以M13和T7为引物，用ABI373A DNA荧光自动序列分析仪分别从两个相反方向测序，以提高结果的可靠性。 1.2.6 总基因组酶切DNA的Southern杂交 用Hind Ⅲ为限制性内切酶；DNA样品按倍性高低取10、15、20μg不等，加6μl 10×buffer、2μl酶，总体积60ml，37℃酶切过夜；电泳、转膜、杂交、洗膜后用CSPD荧光染料，使其胶片感光。
2 结果与分析 2.1 山羊草属S基因组与小麦属B/G基因组的RAPD标记鉴定 根据笔者对Operon公司的OP系列引物一套中470个引物筛选结果，选用132个随机引物对含有不同基因组的山羊草属和小麦属11个种的材料进行RAPD标记鉴定，发现有115个随机引物扩增出483条带。从上述RAPD标记鉴定中选出对山羊草属S基因组(见图1)、小麦属B/G基因组、S基因组和B/G基因组共有特异标记60个。 2.2 特异DNA片段的克隆、测序及特异性分析 以60个RAPD标记做为克隆目的特异DNA片段，有49个得到重组子，用克隆的特异DNA片段做探针，与相应的小麦族23个种属材料RAPD扩增产物进行Southern杂交，其中有24个得到预期结果(其特异RAPD标记见表2)，并有22个得到序列分析结果。根据RAPD及Southern杂交结果，它们可以分为以下几类。2.2.1 山羊草属和小麦属共有特异RAPD标记的克隆 山羊草属和小麦属共有特异RAPD标记共克隆了3个，它们与23个小麦族材料RAPD扩增产物所做的Southern杂交结果见表3的Ⅰ部分。从表3之Ⅰ可以看出，其pTOPZ01385属于小麦族的标记。而另两个标记显示了小麦属与山羊草属的亲缘关系较与小麦族中的其它属近得多，这与前人的传统分析结果相一致。
表2 特异的RAPD标记一览表 Table 2 RAPD markers specific to genomes of Triticeae
2.2.2 S基因组特异RAPD标记的克隆 对S基因组的RAPD标记共克隆了7个，用其做探针与RAPD扩增产物所做的Southern杂交结果见表3的Ⅱ部分。 表3 以特异DNA克隆为探针与相应的RAPD扩增产物 Southern杂交结果 Table 3 Results of Southern hybridization of RAPD profiles amplified by specific DNA clone as the probe
从表3之Ⅱ可以看出，S基因组5个种可以明显分为两大类，即拟斯卑尔脱山羊草为一类，而高大山羊草、沙融山羊草、西尔斯山羊草、双角山羊草为另一类，而且后4个尽管有区别但是基本属于一致。 2.2.3 B/G基因组特异RAPD标记的克隆 一共克隆出B的特异标记3个，B、G共有特异标记3个。用其做探针与23个种属的RAPD扩增产物做Southern杂交的结果见表3的Ⅲ部分。 从表3之Ⅲ可以看出，B/G基因组与S基因组还是有较大区别的，不管B/G基因组的供体是何物种，但自它成为小麦属一个基因组后已有较大改变。另外B与G基因组既有相同的标记，又有不同的可以区别的标记。 2.2.4 S基因组与B/G基因组共有标记的克隆 这类标记一共克隆了8种，用这8个克隆制成探针与其相应的RAPD扩增产物所做的Southern杂交结果见表3的Ⅳ。 从表3之Ⅳ可以看出，山羊草属S基因组与小麦属B/G基因组的亲缘关系很近，由此可以认为B/G基因组是从S基因组进化而来的。而从表3之Ⅳ中的pSBOPV10347、pSBOPO10676、pSBOPI10368为探针的与相应的RAPD扩增产物Southern杂交结果可以看出，在这类种中拟斯卑尔脱山羊草可能贡献最大(见图2)；这些通过克隆特异DNA片段所得到的分子证据与近半个世纪来有些学者利用传统手段提出的关于B组起源的说法相一致。
1 TGGTGGCGTTTAACGGGTTTGTTCTTGTGGTGTTGTTAGTTGGCAATATG 51 TAAAGCAGTTTCTAATTTATTTTTTCATGTACTAAAACATGCATATACTC 101 TCTTGCAGCTTCTATTGTGCTTAGGAAACTGTTGACTGTGCGCCGATTGT 151 TGAGTGATCCTATATTTATCCAAAGTCAATGTCATAGTCTTATAACGCCA 201 CCA 图3 拟斯卑尔脱山羊草的特异RAPD标记OPV18203的核苷酸序列 Fig.3 Nucleotide sequence of Aegilops speltoides specific RAPD marker OPV18203
2.2.5 克隆的特异DNA片段的测序 对上述24个克隆的特异DNA片段进行DNA序列测定，除去pSBOPT17250和pSBOPS16950外，其余22个均得到测序结果(其中pSpOPV18203的核苷酸序列见图3，pSlOPV18205的核苷酸序列见图4)。经查询，有15个序列从Fasta数据库显示为未见报导者，其余7个序列与已报导序列有20%～75%的重复。
1 TGGTGGCGTTGACTGCAGATATGGTTCCCATCACGAGGTATGGTCCTTTT 51 TGGTTTGACCGTTTGCCAAAGATCCTGCATGTTGATCCTGCTCTTATGCT 101 ACTATTTCGGCACTGCCATGATAAAGCAGTAATGTTATTATTTTGCACCT 151 TAATCTAGTGGCACTATTAATTTGAGGCAATGTTTTGGCACCGCTAACGC 201 CACCA 图4 高大山羊草、沙融山羊草、西尔斯山羊草、双角山羊草的特异RAPD标记OPV205的核苷酸序列 Fig.4 Nucleotide sequence of RAPD marker OPV18205 specific to four Sitopsis species other than Aegilops speltoides 2.3 总基因组酶切DNA的Southern杂交 将克隆的特异DNA制成探针，与经限制性内切酶消化后并从琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上的小麦族的23个种的DNA进行Southern杂交，结果从中获得了7个总基因组的标记。 ①pTOPZ01385为探针 在Hind Ⅲ 0.7kb的区段有一条小麦属和山羊草属均很强的杂交带，而在小麦族的其它属，这条带表现不大均匀和一致，其中Ee、Eb、Q、P 4个基因组与小麦和山羊草属一样强，其余则较弱，也可能与酶切有关系。 ②pTOPW19386为探针 在Hind Ⅲ 1.8、1.5、1.3、1.2kb处获得较清晰的杂交信号，其中1.2kb处有一个山羊草属和小麦属共有的特异标记。 ③pSeOPE09534为探针 在Hind Ⅲ 1.87kb的区段有一个高大山羊草、沙融山羊草、西尔斯山羊草、双角山羊草所共有的特异标记。 ④pBOPH04150为探针 仅在硬粒小麦、普通小麦(这两个材料均含有B基因组)的Hind Ⅲ酶切位点的43kb处有一十分清晰的杂交信号，而其它基因组中几乎无任何杂交信号，因此，该标记可以作为B基因组的特异标记(见图5)。 ⑤pSpOPI10266为探针 在Hind Ⅲ 2.6kb的区段有一个山羊草属和小麦属共有的特异标记。 ⑥pSBOPH19389为探针 在Hind Ⅲ 3.1kb的区段有一个具S基因组和具有B、G基因组的种共有的特异标记，而且其中拟斯卑尔脱山羊草与普通小麦的杂交信号最为类似(见图6)。 ⑦pSBOPH18288为探针 在Hind Ⅲ2.7kb的区段有一个具S基因组和具B、G基因组的种共有特异标记。 上述7个由RAPD转成RFLP的新的标记使其应用范围加大，可靠性、稳定性、重复性变得更好。也从另一侧面证明了以下三点：①小麦属与山羊草属具有比其它种属更近的亲缘关系；②S基因组与B、G基因组关系较其它基因组在进化、起源上近得多；③B基因组进入小麦以后较原始供体发生了很大的变化。
3 讨论与结论 3.1 寻找并克隆一些基因组所特有的DNA片段，对于研究物种的起源、进化及远缘杂交育种中外源遗传物质的导入是很有意义的［4］［5］［6］［7］。小麦族植物基因组中重复序列占70%～80%以上［8］［9］，这一特点决定了用RAPD技术得到的大部分基因组专化标记多数将为重复序列［10］；而小麦族植物基因组的同宗性决定了类似于这些专化标记的DNA序列，很可能存在于亲缘关系很近的基因组中［11］。这已被前人的许多研究所证实。用RAPD技术能否从某一特定区段中扩增出该片段，主要决定于该片段两端有无与特定引物相匹配的核苷酸序列［12］。毋须质疑，这些基因组的特异(专化)RAPD标记以及对该标记的克隆和序列分析对揭示多倍体的物种起源和进化是非常有用的［13］［14］。 3.2 本研究利用RAPD扩增物克隆出24个基因组特异(专化)标记，并将其中7个转化为可用于Southern杂交的总DNA标记，22个测定了DNA序列。利用这些标记证实了下列问题： ①从分子水平上进一步证实了在小麦族中，小麦属和山羊草属亲缘关系十分紧密，无论从基因组的关系上，还是遗传标记上均支持这一点。 ②从RAPD分析和其扩增产物克隆及研究表明，S基因组明确地分成2个类型，即拟斯卑尔脱山羊草为一个类型，高大山羊草、沙融山羊草、西尔斯山羊草、双角山羊草为另一个类型。因此，结合其他人的一些研究，建议拟斯卑尔脱山羊草的基因组符号仍保留为“S”，而S基因组的其余4个种已与拟斯卑尔脱山羊草基因组有明显不同，但这4个种之间在基因组上无明显不同，故应把其基因组符号统一为“Sl”。 ③小麦属B、G基因组的供体是S基因组，其中拟卑尔脱山羊草是主要供体。根据对山羊草属和小麦属11个种的RAPD分析和24个RAPD产物克隆及随后用克隆的特异DNA片段作探针，与酶消化的基因组总DNA做Southern杂交的研究表明，S基因组是小麦B、G基因组的供体，而拟斯卑尔脱山羊草可能是最主要的供体。这是因为拟斯卑尔脱山羊草是一个古老的稳定物种；又找到了拟斯卑尔脱山羊草与B、G基因组共同的RAPD扩增产物并已得到克隆化的标记。但并不排除其余S基因组的种也参与了B基因组形成的可能。研究还表明B基因组与S基因组还是有很大区别的，并已找到了B基因组的特异标记。
参考文献 1 Daud H M, Gustafson J P. Molecular evidence for Triticum speltoides as a Bgenome progenitor of wheat (Triticum aestivum). Genome. 1996,39:543~548 2 Talbert L E, Magyar G M,Lavin M, et al. Molecular evidence for the origin of the Sderived genomes of polyploid Triticum species. Am J Bot. 1991,78(3):340~349 3 AnamthawatJonsson K & HeslopHarrison J S. Isolation and characterization of genomespecific DNA sequences in Triticeae species. Mol Gen Genet.1993, 240:151~158 4 Zhang H B, Devorak J. Isolation of repeated DNA sequences from Lophopyrum elongatum for detection of Lophophrum chromatin in wheat genomes, Genome. 1990, 33:283~293 5 Zhang H B, Devorak J. Characterization and distribution of an interspersed repeated nucleotide sequence from Lophopyrum elongatum and mapping of a segregationdistortion factor with it. Genome.1990, 33:927~936 6 Francis H A, Leitch A R, Koebner R M D.Conversion of a RAPDgenerated PCR product, containing a novel dispersed repetitive element, into a fast and robust assay for the presence of a rye chromatin in wheat. Theor Appl Genet. 1995,90:636~642 7 Zhang X Y,Dong Y S, Wang R R.C. Characterization of genomes and chromosomes in partial amphiploids of hybrid Triticum aestivum×Thinopyrum ponticum by in situ hybridization, isozyme analysis and RAPD. Genome. 1996, 39:1062~1071 8 Flavell R B, Smith D B.Nucleotide sequence organization in the wheat genome. Heredity. 1976,37:231~252 9 Smith D B, Flavell R B.Nucleotide sequence organization in the rye genome. Biochim Biophys Acta.1997,474:82~97 10 Penner G A. RAPD analysis of plant genomes.in:Jauhar P P ed. Methods of genome analysis in plant. CRC Press Inc.1996, 251~268 11 Wang R RC, Wei J Z. Variations of two repetitive DNA sequences in several Triticeae genomes revealed by polymerase chain reaction and sequencing. Genome. 1995,38:1221~1229 12 Williams J G K, Kubeilik A R, Livak K J. DNA polymorphisms amplified by arbitary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 1990,18:6531~6535 13 HeslopHarrison J S, Schwarzacher T. Genomic southern and in situ hybridization for plant genome analysis. in: Jauhar P P ed. Methods of genome analysis in plant. CRC Press Inc.1996,163~179 14 Whitkus R, Doebley J, Jonathan F. Nuclear DNA markers in systemmatics and evolution. in:Philips R L et al. ed. DNAbased markers in plants. Kluwer Academic Publisher. 1994,106~2141
Genome relationships among Sitopsis species of Aegilops and the B/G genome of Triticum assessed by RAPD markers
LIU Xu1 Richard R.C. WANG2 JIA Jizeng1 DONG Yushen1 1.ICGR，CAAS, Beijing 100081,P.R.China 2.USDAARS,FRRL,Utah State University, Logan, UT843226300
Abstract Using genomic DNA of 11 species of Aegilops and Triticum as template and 132 single random primers in RAPD assays, we obtained 105 informative markers. RAPD markers specific to, or common to, one or more of the genomes A,B,C,D,U,M, and S (in five species of the Sgenome Sitopsis) were identified. Out of 49 cloned RAPD markers, one was shared by all species in Triticeae, 2 were shared by Aegilops and Triticum, 7 occurred only in the Sitopsis species with the basic S genome, 3 were shared by the B and G genomes, 10 were shared by S and B/G genomes, and 7 were suitable for use as RFLP markers. Results from this study indicated that: (1)the B/G genome of Triticum originated from the S genome prior to divergence of the five species of Sitopsis; (2)further genome divergence after speciation made it impossible to find an existing diploid species of Sitopsis that is genomically identical to the B/G genome in polyploid wheats; and (3) Ae. speltoides was the diploid species sharing the greatest number of RAPD markers with the B/G genome. Supported by the findings of this study and other investigations, it is appropriate and timely to conclude that an immediate progenitor of Ae.speltoides is the principal donor of the B/G genome of polyploid wheats. Key words S-genome; B-genome; RAPD; Clone; DNA sequence |
