作物种质资源的创制、鉴定与利用

-抗除草剂谷子研究

 

王 天 宇

(中国农业科学院作物品种资源研究所,北京,100081)

 

提要:以对除草剂十分敏感的自花授粉作物谷子作为进行抗除草剂遗传改良的模型作物,将从其近缘野生种狗尾草中筛选出的不同的抗除草剂基因,通过远缘杂交等技术途径转移到了栽培谷子中,创制出抗性强、抗性遗传稳定、属不同遗传类型、农艺性状良好、达到实用水平、单抗或复抗除草剂“拿捕净”、“氟乐灵”和“阿特拉津”的谷子新种质。在相关应用基础研究工作的基础上拓建了综合利用新种质的系列方法,建立健全了一套不抗除草剂作物获得抗除草剂特异性的技术路线。

 

关键词:谷子,抗除草剂,种质创新,利用

 

使用除草剂除草被列为二十世纪世界农业十大发明与进步之一。除草剂除草已成为当今农田有效地控制杂草,提高农作物产量与质量,发展农业生产的一项基本措施。抗除草剂育种工程也受到人们的广泛重视,特别是对那些不具抗除草剂特性、不能用除草剂除草的作物尤为重要(Mazur and Falco 1989)。近年来育种技术的发展不仅提高与拓宽了多种作物抗除草剂的性能,而且也使有些对除草剂敏感的作物具有了抗除草剂的特性,进一步扩大了除草剂的使用范围,除草剂的使用与现代农业更加紧密地联系在一起(Gressel 1993),我们选择不抗除草剂的自花授粉作物谷子作为模型作物进行了抗除草剂遗传改良研究。

谷子是世界上传统的粮、饲、草兼用作物,世界各地均有种植,主要分布在亚、欧等地。谷子在我国的种植面积、总产均居世界之首,是我国北方重要的粮食作物。谷子抗旱耐瘠、适应性广、籽粒耐储,随着全球性水资源的匮乏,人们对旱作农业日趋重视,加之小米营养价值高、适口性好,对调节合理的膳食结构能起到积极重要的作用,这些都使得谷子生产呈现出新的发展势头。然而,谷子种子粒小苗弱,谷田除草一直是障碍谷子生产发展的一大世界性难题。主要表现在: 1、现有谷子品种不具有抗现有除草剂的能力,至今谷子生产仍然依靠繁重的手工作业除草间苗,费工费时,难于进行集约化规模种植。2、谷田中杂草种类多,数量大,一些近缘野生种杂草苗期还难于识别,对谷子产量、质量影响很大,一般可造成减产2030%,部分重茬谷田严重时甚至造成绝收。3、谷子花器小,杂交育种困难,谷子种子粒小与许多杂草种子相似,种子加工清选困难,加速了新推广优良品种的混杂退化,使其应用寿命缩短,极大地降低了优良品种的利用效率。4、农业集约化发展,除草剂的施用量大增,谷子对除草剂非常敏感,使用于上茬或邻近其它作物的除草剂的残留与漂移对谷子还时常造成危害。这种局面很难与现代农业相适应。

为了解决这一难题,国内外一些学者曾先后开展了广泛的谷子品种或除草剂的筛选工作,遗憾的是现有谷子品种资源中不具抗源,国内外三千余份代表性谷子资源的鉴定,仅发现个别品种对个别除草剂有一定的耐性,但不能忍耐除草剂的推荐剂量,而采用对谷子损伤小的低剂量除草剂除草的方法效果又欠佳,农民也不好掌握,与实际应用有一定的距离。因此若能从本质上使谷子获得抗除草剂的特性,选育出抗除草剂品种是解决这一问题最经济有效的方法(Gressel 1993,苏少泉1987)。但是由于谷子品种资源中没有高抗除草剂的抗源,利用谷子品种资源进行抗除草剂育种难于凑效,而谷子的近缘野生种资源十分丰富,在世界各地均有分布,这些野生种具有十分广泛的遗传变异类型,是谷子育种改良宝贵的基因库,对谷子的抗性育种具有重要的意义。八十年代以来,国外一些科学家在谷子的某些近缘野生种群体中发现了抗除草剂基因,法国国立农业科学院Darmency博士等人于1985年进行了一种抗除草剂“阿特拉津”野生种狗尾草与谷子的杂交,又以谷子栽培种为父本四代回交,合成了野生种细胞质背景、谷子细胞核、属于细胞质抗除草剂遗传、具有栽培谷子特征的谷子新种质,然而由于这个新种质的细胞质是野生种的细胞质,抗除草剂基因位于细胞质叶绿体上,常规方法无法将其转换为栽培谷子细胞质,即使继续回交其所产生的不良农艺性状也不能克服,这个新种质的高代回交抗性材料与其父本相比,在冷凉、低密度条件下生物产量及经济产量损失较小,达不到显著的水平,但在高温、高密度条件下生物产量及经济产量损失很大,可达30%,十分显著(Darmency et al 1985, Ricroch et al 1987, Reboud et al 1992),因而一直没能应用于生产实践。

在以往国内外研究工作的基础上,我们加强了抗性野生种抗性基因的选择,同时注意到所创制的抗除草剂新种质的实用性选择。从1993年,我们采用远缘有性杂交等技术路线,分别将选择出的加拿大谷子野生资源青狗尾草(Setaria viridisUM1310ak River0R)中的抗除草剂“拿捕净”与“氟乐灵”基因导入到栽培种谷子,将谷子野生种细胞质抗除草剂“阿特拉津”基因转移到栽培种细胞质背景之中,研究了这些抗性性状的遗传规律与抗性水平,继后通过杂交、回交育种获得了抗性基因表达完全、遗传稳定、达到实用水平、单抗或复抗除草剂“拿捕净”、“氟乐灵”、“阿特拉津”的谷子新种质。在此基础上,育成了达到实用水平的系列抗除草剂苗头品种,提出了不同抗除草剂材料在杂种优势利用中去杂、除草,在遗传研究中创制目的材料等方面综合利用研究的系列方案,健全了向谷子导入外源有益基因创制新种质及其加以综合利用的技术路线。

1 抗除草剂新种质的创制

11 抗除草剂“拿捕净”新种质的创制

用谷子栽培品种资源材料C478和不育材料THA1与抗除草剂近缘野生种青狗尾草UM131杂交,借助生化标记鉴定杂种,获得谷子一狗尾草杂种,继后用C478与之回交两代,获得抗除草剂谷子一狗尾草种质D601SRD602SR系列。

D601SR系列等与豫谷1号,冀谷11号, C445,豫谷2号等谷子现有推广优良品种杂交与连续回交5代以上,育成抗除草剂谷子新种质DSB553系列等。

12 抗除草剂“氟乐灵”谷子新种质的创制

用谷子栽培品种资源材料Amende和不育系Shda-l与从加拿大获得的抗除草剂近缘野生种青狗尾草0ak River杂交,借助生化标记鉴定,获得谷子一狗尾草杂种,继后用Amende与之回交两代,获得抗除草剂“氟乐灵”谷子一狗尾草种质材料D206TR系列。

D206TR系列与豫谷1号,冀谷11号,C445,豫谷2号等谷子现有推广优良品种杂交与连续回交5代以上,育成抗除草剂谷子新种质DSB204等。

1.3 抗除草剂“阿特拉津”谷子新种质的创制

我们所利用的抗除草剂“阿特拉津”抗源材料的抗性基因位于细胞质叶绿体,经典遗传理论与方法认为这种基因不能通过花粉进行传递,抗“阿特拉津”谷子-狗尾草基础种质是以抗“阿特拉津”狗尾草作母本,谷子品种作父本进行远缘杂交获得的具有野生种狗尾草细胞质,栽培品种谷子细胞核的合成体。为了使这个位于细胞质中的高效抗除草剂基因转移到栽培谷子细胞质之中而在生产上得以应用,我们尝试用育成的谷子隐性雄性不育系作母本,用携带细胞质抗除草剂基因的种质作父本,进行了大量杂交,对获得的杂种施用除草剂进行抗除草剂新种质的捕获,从1百万余株杂交种中选出了300余株抗除草剂个体,这些个体F1表现可育并携带父本的标志性状,F2遵循期望的比例分离出不育株,证明抗除草剂新个体是来源于设计的组合,尽管转移率很低但这种基因转移是成功的。为了验证试验的可靠性,我们又用了另外4个不育系(基因型)进行了相同的试验,证明试验是可重复的,这种转移基因的方法转移成功率在0.3‰左右。

2 对抗除草剂新种质的鉴定与评价

21 抗除草剂“拿捕净”新种质的鉴定与评价

211 抗除草剂“拿捕净”新种质的抗性表现

苗期抗性生物学实验表明常规不抗除草剂谷子品种施用推荐剂量(480g/ha.)的1/64剂量时即开始死亡,施用推荐剂量的1/8剂量时所有品种全部死亡,LD>9960 g/ha.ED50 = 3 g/ha.。(LD>99为致使99%植株死亡的除草剂剂量,ED50为限制植株生长50%所施用的除草剂剂量),而抗性新种质可以在推荐剂量的24倍用量下存活,LD>9923000 g/ha.Ed50值为2500g a.i/ha.,抗感比达到700倍以上,显示出抗除草剂新种质的高水平抗性。田间试验表明施用除草剂“拿捕净”推荐剂量除草不但不影响谷子的产量,而且有一定的增产作用,其原因一是除草剂除草效果更加有效、彻底,二是多数除草剂在作物能轻易忍耐范围内是作物的生长调节剂,有利于籽实产量的提高。

212 抗除草剂“拿捕净”新种质的交叉多抗性能

抗性新种质不仅抗除草剂“拿捕净”,而且也不同程度抗其它双甲酮衍生物类Ary1oxyphenoxypropionate和环己烷衍生物类Cyclohexanedione除草剂,如Dic1ofopFenoxapropF1uazifopHa1oxyfopQuizalofopTralkoxydim等,尽管其抗性水平不及“拿捕净”高,但较常规品种有大幅度提高。其中Dic1ofop, F1uazifop, Tralkoxydim也具有较高的使用价值。

213 抗除草剂“拿捕净”新种质的抗性遗传分析

新种质抗性遗传稳定,多代自交抗性水平未发生变化。抗感材料杂交、正反交杂种一代均表现抗除草剂,二代符合3:1的抗感分离,回交一代符合1:1的抗感分离,正交与反交、不同剂量药剂处理结果一致。这些结果表明谷子所获得的抗除草剂“拿捕净”特性受细胞核基因组的控制,为一对显性抗性基因作用的结果。

22 抗除草剂“氟乐灵”新种质的鉴定与评价

221 抗除草剂“氟乐灵”新种质的抗性性能鉴定

经新种质的抗性生物学实验确定,抗除草剂新种质可以施用推荐剂量0.8Kgha的除草剂。而一般品种及谷田禾本科杂草在这个剂量下不能生存。

抗除草剂“氟乐灵”基因的导入使得谷子获得抗二硝基苯胺Dinitroaniline类除草剂的性能,抗性新种质不仅抗除草剂“氟乐灵”Trifuraline,而且也不同程度抗其它如BenfluralineButralineOryzalinePendimethaline等二硝基苯胺类除草剂,施用不同的药剂,出苗率及生长量抗感比R/S提高333倍。不同条件抗感近等基因系的结果表明谷子获得抗除草剂“氟乐灵”基因不会对生物学产量产生显著影响。

222 抗除草剂“氟乐灵”特性在谷子中的抗性遗传分析

抗除草剂新种质抗性遗传稳定,多代自交抗性水平未发生变化,抗感除草剂特性可通过培养皿芽期鉴定的方法得以确认,0.1 ppm的“氟乐灵”溶液对种子的发芽没有影响,种子发芽后对感除草剂的幼芽有强烈的抑制生长作用,受害的感除草剂幼芽即使移栽到不含除草剂的培育基之中,植株也不能被拯救成活,危害是不可逆转的,但对抗除草剂种子幼芽不产生显著的影响,幼芽可忍耐这个剂量。

抗感材料杂交,正反交杂种一代均表现感除草剂,表明抗除草剂“氟乐灵”特性受细胞核隐性基因控制。4个不同的组合F2分离出的抗除草剂植株均为15%, 抗感分离比例不符合3:1,15:1,13:3,表明抗性不是简单的一对或两对隐性基因控制的独立遗传。为此进行了进一步的试验,结果是:1、由抗除草剂F2的个体所得到的F3均表现100%抗除草剂,2、随机抽取148个F2株系种植,对获得的F3种子进行鉴定,结果这些F2可被分为三种类型:其中39%F2的后代为感除草剂,无抗除草剂个体出现,45.5%为感除草剂与抗除草剂分离,15.5%为100%抗除草剂个体,进一步研究确定F2群体中15%抗除草剂个体是携带纯合隐性抗除草剂基因的个体。由抗除草剂F2获得的抗除草剂F3植株与其他常规品种杂交所得到F2也显示接近15%的结果,可见这些不符合3:1分离结果显示出抗性基因间的连锁关系及其背离因素是代代相传的遗传因素,根据Allard(1956)建立的方法,这种抗性的遗传可以用两对隐性连锁基因互作得以解释,在染色体Coupling phase期,F2群体中抗除草剂个体出现的频率应该是(1:4)(1-r)2,得出 r = 0.23±0.02。基于此计算,自交F2将产生5种抗性植株分离频率,即0%;2.5%(为(1:2)r2);15%(为(1:4)(1-r)2);25%(为(1:3))和100%,按Allard的方法,这5种频率可归结为三种类型:即感除草剂类型(0和2.5%),抗感分离型类型(15%和25%)和抗除草剂类型,由此得出的r值与从F2得到的值是一致的 r = 0.23±0.08,印证了抗除草剂“氟乐灵”的抗性可能是受两对连锁的细胞核隐性基因互作的控制。

23 抗除草剂“阿特拉津”新种质的抗性表现

对所获得的新型细胞质抗除草剂材料在高温高密度条件下进行选择,选出了改良的抗除草剂谷子新种质AR6127等。随后通过对其主要产量性状的调查并与其近等基因系的比较证明,新种质克服了原种质野生种细胞质的弊病,对各性状方差分析表明新种质与其近等基因系的差异均未达到显著水平。遗传研究表明抗性仍属于细胞质遗传,抗性实用性试验证明新种质对“阿特拉津”仍具有很高的抗性。

3.抗除草剂谷子新种质的综合利用

31 利用抗除草剂新种质选育抗除草剂新品种

利用上述不同类型抗除草剂新种质与全国各主要生态区的推广优良品种进行抗除草剂育种改良,通过杂交、回交和对后代抗性个体的选择,育成了抗除草剂“拿捕净”谷子新品系SR3840、SR3522,抗除草剂“阿特拉津” 谷子新品系AR397、AR638,抗除草剂“氟乐灵”谷子新品系TR68、TR2和复抗这三种除草剂的SAT1663等系列品种。其抗性水平及农艺性状均已达到实用水平,目前正在适宜地区进行示范与发展研究。部分品种从河南郑州至辽宁铁岭、河北张家口均表现较好,这种广泛的适应性在以往谷子育成品种上也不多见,这是采用动态穿梭育种的结果(先后在北京,石家庄,海南,法国,气候箱进行了选择)。同时我们组成了全国谷子抗除草剂育种协作组加强抗除草剂新品种的育种改良和配套技术研究,旨在将这项实用技术较早大面积应用于我国的谷子生产实践。

32 利用抗除草剂新种质提高杂种优势利用水平

利用杂种优势是提高作物产量与质量最为有效的途径之一。我国谷子杂种优势利用方面一直处于世界领先地位,应用方面育成了核隐性高度雄性不育两用系(不育株率100%,不育度95%),这种不育系易转育,易恢复,易利用,与恢复系所配制的高度雄性不育两系杂种产量高、品质好,对于制种生产的杂种中所夹杂的假杂种(不育系)苗期根据指示性状(苗色)去除,这条途径部分组合已通过省区试进入应用阶段。但是进入生产实践大面积应用,仍存在一定的问题:首先高度雄性不育系配制的杂种表现真杂交率不高(通常只为4080%),大面积的大田利用苗期指示性状去除假杂种困难,更增加了栽培谷子的难度;其次,种子生产单位安排的不育系繁种隔离区不严格,时常受到非目的花粉的侵染,不育系纯度难于保证;此外,制种中由于自花授粉作物通常花粉量小,花粉的传播距离相对较小,目前的不育系与恢复系间隔种植杂交率不高,即使加上人工辅助授粉效果也不理想,致使制种质量与效益提高受到限制。当然,纵观谷子以及其他作物、其他形式杂种优势利用研究与开发,如光(温)敏不育,三系,显性核互作不育,化学杀雄不育等各种类型不育系配制的杂种也因其本身不育系的纯度、气候条件的影响、非规范化操作、机械混杂等原因极易造成大田使用的杂种纯度低,导致生产上利用杂种的杂种优势提高作物产量与质量的水平降低,致使杂种优势利用技术广泛推广受到了制约。因而,保持好不育系纯度,提高杂交结实率与制种产量,保证杂种群体纯度是利用好杂种优势的技术关键。为此,我们拓建了利用抗除草剂基因提高杂种优势利用水平的新途径。

321 利用显性抗除草剂“拿捕净”基因选育新型恢复系,所得杂种可施用药剂去杂、除草

通过杂交和回交育种把显性抗除草剂“拿捕净”基因转育到作恢复系的品种之中,获得了携带纯合抗除草剂基因的新恢复系,用这样的恢复系与不育系配制的杂种表现为抗除草剂特性,利用时通过一次施用除草剂就可同时去除假杂种、杂株和杂草,获得整齐一致的杂种群体。显然用这样的恢复系进行杂交种制种不需严格的隔离区,更有利于其推广利用。另外,由于抗除草剂基因会对产量性状产生正效应,因此用这样的恢复系也有助于提高杂交种的产量优势。

322 利用隐性抗除草剂“氟乐灵”基因保存不育系

通过杂交和回交育种把隐性抗除草剂“氟乐灵”基因转育到了育成的各类不育系(或保持系)之中,这样的不育系在繁种时,不育系接受外来常规品种等非目的性的花粉所得到的种子感除草剂,所以通过施用除草剂就可同时去除杂株和田间杂草,保证了不育系的纯度,降低其繁种隔离条件,简化不育系繁殖的程序。

323 利用细胞质抗除草剂“阿特拉津”基因创制新型不育系,提高杂交结实率和制种产量

通过有性杂交育种将不育基因转移到细胞质携带抗除草剂基因遗传背景之中或将细胞质抗除草剂“阿特拉津”基因转移到优良不育系(通常直接有性杂交转移率较低,为0.03%左右)中,用这样的不育系制种时,将不育系与恢复系混种或贴行种植(缩短花粉供体与受体株的距离)可提高父母本杂交率与制种产量,这样的不育系所配制的杂交种利用时,一次施用除草剂就可同时去除所生产种子中夹杂的恢复系、杂株和杂草,既提高了杂交种制种田杂种的产量,又保证了杂种应用田杂种群体的纯度,也提高了杂种的种植水平。

33 利用抗除草剂基因拓建遗传研究的各类群体

谷子是严格的自花授粉作物,花器小,杂交十分困难,使得许多遗传研究难于进行。所获得的不同的抗除草剂新种质是进行各类遗传研究十分有价值的工具材料,利用其可简化杂交程序,提高杂交、回交成功准确度、可信度。例如F1植株群体的拓建可将要研究的材料与显性抗除草剂品系的穗子套在一个纸袋内,收获被研究材料的种子种植,通过使用除草剂可获得可信的杂交种F1植株。

4.结束语

我国谷子常年播种面积在三千万亩左右,谷子抗除草剂新品种的育成并安全有效地应用将对谷子栽培生产起到重大的变革作用,预示着人们盼望的精量播种不间苗,免中耕除草,提高谷子种植水平,建立集约化农业生产体系将成为现实。这不仅可节约大量的人力和财力,而且利用谷子抗旱耐瘠的特性结合施用除草剂,至少还可在三北脆弱农业生态区的荒地、旱地上开发大量的谷田,增收的粮食可解决贫困地区数百万人的吃饭问题。其次以谷子为模型提出的利用不同抗除草剂基因提高作物杂种优势利用水平的新设想,在不同程度上可解决困扰杂种优势利用中制种难、剔除假杂种难、不育系保纯难以及除草难等多项技术问题,这一方法的积极效应,还在于它对其他作物杂种优势利用研究有着重要的参考与借鉴意义。另外利用几种抗除草剂基因的作用可有效地拓建各种基因型个体或群体,对促进谷子的基础研究也具有重要意义。

 

A creation, evaluation and utilization of the new crop germplasm: herbicide resistance foxtail Millet (Setaria italica)

Wang Tianyu

Institute of Crop Germplasm Resources, CAAS, Beijing, 100081, China

 

Abstract: Breeding and engineering crops for improved herbicide resistance is a recent concern. Genes for resistance are highly desired in cases where no selective herbicide is available to control weeds. That is the case for the foxtail millet, Setaria italica (L.) Beauv.. The different herbicide resistant germplasm of millet to sethoxydim, trifuralin and triazine with good agronomy performance have already been released after interspecific hybridization with relevated plant, S.viridis (L.) Beauv.. A single dominant, two linked recessive loci and maternally inherited patterns have been found for sethoxydim, trifuraline and atrazine resistance, respectively. Several comercial lines have been bred out, which are highly resistant to relevant herbicides and the chemicals of same family. A model in improvement of the herbicide resistance for crop that has no selective herbicide was estibalished.

Key word: Foxtail millet, Herbicide resistance, New germplasm resources, Utilization