|
基于醇溶蛋白的20份小麦种质遗传完整性分析
任守杰1,2，张志娥2，陈晓玲2，王建华1，卢新雄2
（1中国农业大学农学与生物技术学院
北京
100094；2中国农业科学院作物科学研究所/农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室
北京
100081）
摘要：采用醇溶蛋白电泳技术对同一品种但繁殖年份不同的20份小麦种质进行了遗传完整性分析。结果表明：供试种质中有10份具有一种醇溶蛋白谱带带型的同质性种质。另外10份具有2~4种醇溶蛋白谱带带型的异质性种质，其中6份为地方品种，表明地方品种具有较高的遗传多样性。在10份异质性种质中，两个繁殖年份种质之间的醇溶蛋白带型频率变化差异不显著的有5份，其第一繁殖年份的种质发芽率均高于75％，而对于另外5份存在显著差异的种质，第一年份的发芽率都低于66％。进一步分析表明，这10份异质性种质在两个繁殖年份之间，其发芽率差值与带型频率差值之间呈极显著正相关，相关系数为0.86648。上述结果表明更新发芽率水平是维持异质性种质遗传完整性的关键因素。
关键词：小麦；醇溶蛋白；遗传完整性；种质保存
Genetic
Integrity of 20 Wheat Accessions Based on Gliadin Analysis
REN
Shou-jie1, 2, ZHANG Zhi-e2, CHEN Xiao-ling2,
WANG Jian-hua1, LU Xin-xiong2
(1College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100094；2Key
Laboratory of Crop Germplasm & Biotechnology，Ministry of Agriculture/ Institute of Crop Sciences,
Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstract:
The genetic integrity of 20 wheat accessions from different propagation
times was studied by PAG-electrophoresis. The result showed that there
were 10 genetically homogeneous accessions
having only one gliadin spectrum biotype and 10
genetically
heterogeneous accessions having two to four gliadin spectrum biotypes.
Among 10 genetically heterogeneous accessions, 6 were landraces. It
showed that landraces had high heredity variation. The germination
percentages before regeneration were higher than 75% for the 5
genetically heterogeneous accessions in which the differences of
frequency of gliadin spectrum biotypes were not significant between the
two populations propagated in different years. But for other 5
genetically heterogeneous accessions, the differences of frequency of
gliadin spectrum biotypes were significant between the two populations
propagated in different years and their germination percentages were
lower than 66%. The result also showed that the difference of
germination percentage was positively correlated with difference of the
frequency of biotypes at 1% level of 10 genetically
heterogeneous accessions, and the correlation coefficient was 0.86648. The result indicated that the propagation
germination percentage was the main factor for maintaining the genetic
integrity of heterogeneous germplasm.
Key
words：Wheat；Gliadin；Genetic
integrity；Germplasm
conservation
作物遗传资源可分为遗传上同质种质（Genetically
homogeneous accessions）和遗传上异质种质（Genetically
heterogeneous accession）。前者指在一份种质内，其个体之间基本上具有相同的遗传结构，如自花授粉作物品种、异花授粉作物自交系等；后者指在一份种质内，其个体之间不具有相同的遗传结构，如野生种、原始地方品种、异花授粉的栽培品种等[1]。许多报道指出，对于原先是同一份种质，尤其是遗传上异质种质材料，在不同繁殖世代[2]、不同贮存年限[3]或不同种质库之间[4]其遗传组成存在着差异或显著差异。为此，维持种质库保存种质资源的遗传完整性已越来越引起人们广泛重视。在我国国家作物种质库中，已保存着150余种作物34万份种质资源，其中约80％的种质属于遗传上异质种质材料。此外全国还有20余座作物种质资源中期库，不少种质材料保存于这些不同种质库中，也分别来自不同的繁殖年份。因此，本文利用小麦醇溶蛋白电泳技术来分析20份小麦种质材料，以研究繁殖年份不同的同一种质材料之间是否存在遗传差异，这对于制定适宜的遗传保存与更新策略，以维持种质的遗传完整性具有重要实践指导意义。
1
材料与方法
1.1供试材料
供试小麦种质材料20份，其中10份为国外引进品种、3份为国内选育品种和7份为国内地方品种，每一份种质各有两个不同繁殖年份，其繁殖年份见表1。一般情况下，后一繁殖年份的种质是前一年份种质繁殖更新的后代。供试种质材料在繁殖收获后就一直保存于中期库，贮存温度4±2℃。
1.2
室内发芽率测定
种质发芽率测定于醇溶蛋白电泳前进行，测定方法参照《国际种子检验规程》[5]，发芽温度25℃
，发芽床采用两层滤纸，逐日查发芽数，第4天统计发芽势，第7天统计发芽率。
1.3
A-PAGE分析
参照ISTA1986年颁布的小麦种子醇溶蛋白电泳标准程序[6]，单粒种子磨碎后，按每1mg加5uμl样品提取液室温单粒提取醇溶蛋白，以中国春和加拿大春小麦Marquis作为对照，每份种质分析种子
90粒，分3个重复，每一处理30粒。
1.4
醇溶蛋白谱带分析
依照Bushuk和Zillman的相对迁移率系统，即以Marquis的三条谱带，迁移率分别为24.0、50.0 和79.0，作为标准参照带，计算小麦醇溶蛋白的相对迁移率[7]。利用原中国农业科学院作物品种资源研究所计算机室和浙江大学合作编写的软件“GEL2.0”进行醇溶蛋白电泳图谱的自动识别和分析比较。
1.5
数据分析
试验数据采用t-测验进行差异显著性分析。
2
结果与分析
2.1
小麦种质醇溶蛋白谱带型
分析表明，在供试小麦种质材料中，每一种质材料其醇溶蛋白谱带图谱不一样，且其含有谱带带型种类数目也不一样，为1～4种。为便于分析，对于每一份种质，若所含谱带带型种类仅1种，就命为I，若含有4种类型就分别命为I、II、III、IV。图1和图2为小麦种质MY002889所含的醇溶蛋白4种谱带类型的电泳图谱和模式图，并分别命为I、II、III、IV谱带型。
在20份小麦供试材料中，10份种质材料只具有一种醇溶蛋白谱带带型，包括7份国外引进品种、2份国内选育品种和1份地方品种。而另外10份分别具有 2~4种不同的醇溶蛋白谱带带型，包括6份国内地方品种、3份国外引进品种和1份国内选育品种，见表1。Stoyanova认为醇溶蛋白每一谱带型代表一种生物型（Biotype）[8]，因此具有一种醇溶蛋白带型的小麦种质属于遗传上同质材料，而含有2种以上带型的种质，则可认为是属于遗传上的异质材料，故在供试材料中有10份属于遗传上异质材料，其中6份属于地方品种，由此也反映出地方品种具有较高的遗传多样性。
图1 MY002889醇溶蛋白电泳图谱
Fig.1
Electrophoretic patterns of MY002889(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
and Ⅳ Biotypes)
using
Marquis(M) and Chinese Spring(C) as standards
图2
MY002889醇溶蛋白谱带图形模式图
Fig.2
Diagrams of the gliadin spectra using a computer system for describing
表1
20份小麦种质的醇溶蛋白谱带型数及其频率
Table 1 The number of gliadin
spectrum biotypes and frequency of every biotypes in 20 wheat accessions
|
统一编号
Accession
No.
|
种质类型
Germplasm type
|
繁殖年份
Propagation
time
|
发芽率（%）
Germination
percentage
|
带型数
No.
Of Gliadin spectrum biotypes
|
带型出现的频率（%）
Frequency
of gliadin spectrum biotypes
|
|
Ⅰ
|
Ⅱ
|
Ⅲ
|
Ⅳ
|
|
MY000024
|
国外引进
|
1993
|
66
|
4
|
39.98
|
28.24
|
24.71
|
7.06
|
|
|
|
2000
|
95
|
4
|
52.20
|
13.43
|
20.66
|
13.71
|
|
MY000080
|
国外引进
|
1993
|
60
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
2000
|
89
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
MY000092
|
国外引进
|
1993
|
76
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
2002
|
73
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
MY000347
|
国外引进
|
1993
|
82
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
2000
|
95
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
MY000747
|
国外引进
|
1993
|
71
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
1998
|
75
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
MY001063
|
国外引进
|
1995
|
6
|
1
|
100
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
1999
|
3
|
1
|
100
|
-
|
-
|
-
|
|
MY001066
|
国外引进
|
1993
|
46
|
2
|
82.56
|
17.44
|
-
|
-
|
|
|
|
1999
|
50
|
2
|
90.68
|
9.32
|
-
|
-
|
|
MY001457
|
国外引进
|
1993
|
87
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
1998
|
88
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
MY002492
|
国外引进
|
1993
|
65
|
1
|
100
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
2000
|
93
|
1
|
100
|
-
|
-
|
-
|
|
MY002889
|
国外引进
|
1993
|
77
|
4
|
82.22
|
10.00
|
4.44
|
3.33
|
|
|
|
1995
|
75
|
4
|
86.67
|
4.44
|
4.44
|
4.44
|
|
ZM000614
|
国内地方
|
1998
|
76
|
2
|
84.44
|
15.56
|
-
|
-
|
|
|
|
2000
|
81
|
2
|
87.42
|
12.58
|
-
|
-
|
|
ZM000719
|
国内地方
|
1996
|
92
|
3
|
59.32
|
28.60
|
12.08
|
-
|
|
|
|
2003
|
92
|
3
|
55.56
|
32.22
|
12.22
|
-
|
|
ZM001582
|
国内地方
|
1996
|
26
|
4
|
84.57
|
15.43
|
-
|
-
|
|
|
|
2000
|
59
|
4
|
94.91
|
5.09
|
-
|
-
|
|
ZM001595
|
国内地方
|
1998
|
98
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
2000
|
72
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
ZM002941
|
国内地方
|
1996
|
92
|
3
|
83.64
|
9.33
|
7.03
|
-
|
|
|
|
2003
|
98
|
3
|
79.11
|
12.77
|
8.13
|
-
|
|
ZM003042
|
国内地方
|
1993
|
41
|
2
|
82.94
|
17.06
|
-
|
-
|
|
|
|
2003
|
90
|
2
|
71.80
|
28.20
|
-
|
-
|
|
ZM003448
|
国内地方
|
1996
|
97
|
2
|
78.89
|
21.11
|
-
|
-
|
|
|
|
2003
|
100
|
2
|
77.47
|
22.53
|
-
|
-
|
|
ZM008962
|
国内选育
|
1992
|
91
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
2000
|
99
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
ZM009099
|
国内选育
|
1992
|
23
|
2
|
95.56
|
4.44
|
-
|
-
|
|
|
|
2000
|
62
|
2
|
82.25
|
17.75
|
-
|
-
|
|
ZM009654
|
国内选育
|
1996
|
76
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
|
|
|
2003
|
96
|
1
|
100.00
|
-
|
-
|
-
|
2.2同一种质不同繁殖年份的醇溶蛋白谱带型频率变化
在所有20份供试材料中，同一种质不同繁殖年份材料之间，尽管种质发芽率水平和繁殖世代数存在差异，但其醇溶蛋白谱带图谱没有发生变化，这表明繁殖更新和发芽率水平对小麦醇溶蛋白谱带型及其谱带种类数目都没有产生影响。但对于具有2种以上谱带带型的10份异质种质材料，其谱带带型之间的频率出现了变化，见表1，如MY000024共有4种不同的蛋白谱带类型，繁殖年份为1993年种质，其醇溶蛋白带型Ⅰ类型和II类型出现的频率分别为39.98%和28.24%，繁殖年份为2000年的种质，其Ⅰ和II类型出现频率分别为52.20%和13.43%，分别比1993年繁殖种质增加了12.22%和降低了14.81%；MY002889、ZM002941、ZM000614 、ZM000719、和ZM003448
等5份异质性种质不同繁殖年份之间，醇溶蛋白带型频率的差异不显著。从表2中可以看出，这5份种质的第一繁殖年份的发芽率都不低于75％，而MY000024、MY001066、ZM001582
、ZM003042和ZM009099等5份种质在两个繁殖年份之间，至少有一种带型频率发生变化，且达5%差异显著水平，而其发芽率差值一般较大或第一繁殖年份发芽率较低（≤66％）。
进一步分析表明，这10份异质性种质在两个年份材料之间，其发芽率差值与带型频率绝对差值存在正相关关系，相关系数为0.86648，达到极显著差异。
表2
两个繁殖年份种质材料醇溶蛋白带型频率差值及差异显著性测验概率值P（t-测验）
Table
2 The
difference of gliadin spectrum biotypes between
the two populations propagated in different years and the value of P
(t-test)
|
统一编号
Accession
No.
|
发芽率差值x（%）Difference
of germination percentage
|
Ⅰ带型频率差值y（%）
Difference of
Ⅰbiotype
frequency
|
带型频率差异显著性测验概率值P（t-测验）
Probability of biotypes
frequency
by t-test（%）
|
|
Ⅰ
|
II
|
III
|
IV
|
|
MY000024
|
29（95-66）
|
12.22
|
0.0253*
|
0.4537
|
0.0839
|
0.0876
|
|
MY001066
|
4.0（50-46）
|
8.12
|
0.0220*
|
0.0220*
|
-
|
-
|
|
MY002889
|
-2（75-77）
|
4.45
|
0.2050
|
0.9995
|
0.3752
|
0.0668
|
|
ZM000614
|
5（81-76）
|
2.98
|
0.3799
|
0.3799
|
-
|
-
|
|
ZM000719
|
0（92-92）
|
3.76
|
0.4245
|
0.5124
|
0.9783
|
-
|
|
ZM001582
|
33（59-26）
|
10.34
|
0.0337*
|
0.0337*
|
-
|
-
|
|
ZM002941
|
6（98-92）
|
4.53
|
0.4241
|
0.3283
|
0.6409
|
-
|
|
ZM003042
|
49（90-41）
|
11.14
|
0.0470*
|
0.0470*
|
-
|
-
|
|
|
3（100-97）
|
1.42
|
0.7332
|
0.7332
|
-
|
-
|
|
ZM009099
|
39（62-23）
|
13.31
|
0.0269*
|
0.0269*
|
-
|
-
|
|
相关系数
Correlation
coefficient
|
|
|
|
|
|
|
回归方程
Regression
equation
|
|
|
|
|
|
发芽率差值一栏中括号内的值为两个繁殖年份的种质发芽率；*差异在5%水平上显著；**差异在1%水平上显著
The values in brackets
were germination percentages of the two populations propagated in different
years；* Significant
at 5% level；* * Significant
at 1% level
3 讨论
醇溶蛋白具有复杂的多态性，其带纹及组合方式完全受基因控制，几乎不受环境的影响。为此，醇溶蛋白分析不仅应用于品种或种质资源鉴定[6,9,10]、种质资源遗传多样性[11,12,13]、种子纯度检验[14]，还应用于种质遗传完整性变化研究[8,15,16]。Stoyanova依据醇溶蛋白谱带带型的差异，研究发现小麦地方品种Sadovo1含有A、B、C、D
4种类型的Biotype，当种子发芽率下降到30%以下，仅个别D型和大部分B型Biotype植株存活，而C型和A型Biotypes已消失[8]。张晗等对大麦地方品种普乃干木进行醇溶蛋白谱带分析时，发现随着发芽率的下降，该份种质的四种谱带带型频率不仅发生了变化，而且当发芽率降到34%时，蛋白带型III的Biotype也随之消失[16]。本研究结果也表明，利用醇溶蛋白分析技术也检测到同一种质不同年份繁殖的材料之间，如10份小麦异质材料的带型频率出现了变化，而且不同繁殖年份材料之间的发芽率差值与带型频率变化幅度之间存在显著正相关关系。因此，醇溶蛋白分析可应用于进行小麦异质性种质遗传完整性的检测研究。
种质资源保存的关键问题是要确保种质遗传完整性的维持，即使群体遗传结构得到完全的保持，包括群体的基因型频率分布及等位基因频率分布和原始群体一样。在本试验中发现了很有趣的现象：在10份小麦异质性种质中，两个繁殖年份之间的醇溶蛋白带型频率变化不显著的5份异质性种质中，其第一繁殖年份种质的发芽率都高于75％，而醇溶蛋白带型频率变化显著的另外5份异质性种质，其更新发芽率都低于66％，说明对于异质性种质来说，确定相对较高的种质繁殖更新发芽率标准是非常重要的。
致谢：本研究中所用小麦种质材料由本所麦类室李立会研究员和李秀全老师提供，在此表示衷心的感谢！
参考文献
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