（¹中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京100081; ²保加利亚农业科学院遗传研究所, 索非亚113; ³西南大学园艺园林学院, 重庆 400716）

摘要：含有ps-2雄性不育基因的番茄材料可通过自交获得100％的不育后代，方便地应用于番茄杂交制种。本文以来自保加利亚含有ps-2基因的不育材料CMC1ps2为母本，以优良的加工番茄92155为父本，构建了123个F₂代分离群体，育性表型分离比例完全符合孟德尔遗传规律，为单基因隐性遗传。采用 AFLP分子标记技术，通过筛选64对AFLP引物组合，获得了与可育Ps-2位点紧密连锁的3个AFLP标记 （E37/M47 、E38/M48及E33/M50），它们与可育基因的遗传图距分别是6.04cM、6.04cM、6.06cM，而且位于可育基因的同一侧，位置基本相同，分别扩增出390bp、150bp、80bp的DNA片断。这3个标记的获得，可直接用于标记辅助选育，加速番茄雄性不育的转育和利用。

LI Jun-ming¹, ZHU Sha^1,3, SONG Yan¹, ZHANG Zhi¹, Bistra Atanassova², ZHANG Sheng-lin³ , XU He-jin¹

(¹Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; ²Institute of Genetics‘Acad.D. Kostoff ’, Bulgarian Academy of Sciences , Sofia113 ; ³College of Horticulture and Landscape, Xi Nan University, Chongqing 400716)

Abstract: Tomato germplams with ps-2 gene could easily produce the progeny with 100% sterility through selfing. It has been conveniently used for F₁ hybrid production. In this paper, 123 individuals of F₂ segregated population were derived from Bulgaria line CMC1ps2 containing ps-2 gene as a male parent and a virtual processing tomato line 92155 as a female parent. The segregation ration of fertility and sterility in this population completely meet the Madeline genetic mechanism as a single recessive gene. AFLP technology has been used to obtain the markers tightly liked with ps-2 gene. 64 AFLP primer combinations were screened and 3 AFLP markers including E37/M47 、E38/M48及E33/M50 have been identified to tightly linked with Ps-2 fertile loci. The genetic distances were respectively 6.04cM、6.04cM、6.06cM, and all of them were located one side with Ps-2 loci. The marker position was almost same. These marker amplified respectively 390bp、150bp、80bp DNA fragment. 3 AFLP markers obtained in this paper could be directly used for maker-assistant selection and speed up the introgression and use of male sterility for tomato production.

Key words: Tomato；Ps-2 loci；AFLP markers

雄性不育已被广泛应用于白菜、甘蓝等蔬菜作物。利用雄性不育制种可简化程序、节省人工、提高纯度。我国番茄一代杂种生产均采用人工去雄授粉，生产制种时每年需投入大量的人力物力，而且这种制种方式程序繁杂、成本高、纯度也难以达到100%，从而限制了番茄杂种优势的进一步利用。对番茄而言，目前已发现大约60多个雄性不育自然突变体，但均因各种原因未能应用于生产^[1,2]。Atanassova等^[3]经过20多年对不同类型不育材料的反复研究，目前已成功利用含ps-2基因的功能型雄性不育系进行杂交制种，而且在捷克、罗马尼亚、保加利亚等国家得到了大面积使用，其中保加利亚利用该不育系每年生产约1吨杂交种子，占总生产量的30%。分子标记辅助选育有效地加快了作物遗传改良，其中AFLP是目前作图效率最高的一种标记，可检测到的谱带数在50~ 100条之间，多态性好的酶切引物组合，一次可以检测到20个以上的多态性，所以是多态性检测的一种非常有用的技术^[4]。本文利用多态性丰富的AFLP技术，获得了与可育Ps-2位点紧密连锁的标记，采用反向选择策略，可方便地用于番茄雄性不育辅助选育。

1. 材料与方法：

1.1 材料

试验以从保加利亚科学院遗传所引入的含有ps-2基因的稳定不育品系CMC1ps2为母本，以中国农科院蔬菜花卉所加工番茄组培育的有限生长类型优良加工番茄92155品系为父本，配制了123个F₂代分离群体。AFLP引物及用于本试验的全部药品均由上海生物技术工程公司合成和提供。其中AFLP引物包括E32 、E33、E35、E36、E37、E38、E40、E41和M47、M48、M49、M50、M59、M60、M61、M62等组成的64对随机引物组合。

1.2 方法

1.2.1 田间群体育性鉴定 2003年春季分别将92155、CMC1ps2、F₁及F₂分离群体定植于大棚，田间自然授粉坐果，待F₁植株第4穗果实开始膨大时，调查上述所有材料的田间自然坐果率。根据坐果率确定单株育性，坐果率为0或坐果但均为僵果的单株确定为不育单株。

1.2.2 DNA的提取 对上述全部材料，于幼苗期分别提取DNA。DNA的提取参照Haanstra等^[4]方法，采用CTAB微量法，取幼嫩的番茄真叶一片，放入研钵，加液氮快速研磨成粉末状，转入2ml离心管，加500μl 65℃预热的2 %CTAB缓冲液，在Retsch mixer mills MM 301仪器上充分破碎2min，65℃水浴45min，轻轻振荡几次。取出在冰上冷却，加入等体积的酚：氯仿（1:1）混合液，混匀10min后，8000rmp离心10min。取上清液，加入250μl氯仿：异戊醇（24:1），混匀10min后，13000rmp离心10min。取上清液转入2ml新离心管中，加入2倍体积的冰无水乙醇和1/10的3M的NaAc。轻轻混匀后，静置－20℃冰箱约30min。将DNA转入1.5ml离心管并吹干。加入50μl的TE过夜（4℃）溶解。然后加入RNAse (10mg/ml) 10μl于37℃保温1h。再用氯仿：异戊醇纯化，最后溶解在50μl的TE溶液中，用0.8%的Agrose胶检测浓度。终浓度稀释为25ng/μl，贮藏在-20℃的冰箱中用于AFLP分析。

1.2.3 不育池和可育池的构建 根据植株育性调查结果，随机选取15个可育和15个不育单株，分别将DNA等量混和构成可育池和不育池。

1.2.4 AFLP 分析 AFLP分析参照Vos等的方法^[5]。番茄基因组选取EcoRⅠ和MseⅠ作为限制性内切酶；预扩增引物为不含选择性的E00和M00。选择性扩增后，在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离扩增产物。银染参照Bassam等^[6]的方法。染色后对扩增条带进行统计，只有清晰可见的条带被认为是扩增产物，有带记为1，无带记为0，模糊不清的记为“－”，统计结果用于相关分析。

1.2.5 数据分析 表型和基因型分离比例的卡平方测验用EXCELL软件完成。分离群体的育性和分子标记的分离数据连锁分析用Join Map 3.0软件进行。

2. 结果与分析

2.1 F₂群体单株的田间育性分离

对父母本、F₁及123个F₂分离群体单株田间育性调查结果（表1）表明，母本不育，父本可育，F₁的10个单株均可育，而F₂代分离群体的育性出现明显分离。123个群体单株中，91个单株可育，32个单株不育，分离比例为2.84:1，经卡平方测验不显著，符合3:1的孟德尔遗传规律，说明番茄雄性不育ps-2基因的为单隐性基因，这和国外研究结果完全吻合。

表1 父母本、F₁及F₂分离群体田间育性

Table1 The fertility of female parent, male parent, F1 and F2 segregation population in the field

　

材料 Material	总株数 No. of total plants	可育株 No. of Fertile plants	不育株 No. of sterile plants	分离比例 Segregation Ration	卡平方测验 x2	显著性 Significant
92155	10	10	0	1：0	－	－
CMC1ps2	10	0	10	0：1	－	－
F1	10	10	0	1：0	－	－
F2	123	91	32	2.84:1	0.067	不显著 None significant

2.1 AFLP多态性引物筛选

利用64对AFLP引物组合对父母本进行筛选，每对引物组合可扩增出50~60条清晰可见的条带，只有22对可在父母本间产生多态性，而且均出现可育父本有带，而不育母本无带的情况，多态性条带一般为2~4条，说明两个栽培种间的遗传差异不明显，因为AFLP技术通常具有很强的检测多态性的能力。对入选的22对引物，进一步利用不育池和可育池进行筛选，鉴定出E37/M47、E38/M48、33/M50、E37/M48等4对引物可在不育和可育池间产生多态性，其中3对可稳定、清晰地扩增出差异片断，因此这3对引物很可能与可育的Ps-2位点连锁。

2.3 与Ps-2基因紧密连锁的AFLP标记的获得

利用123个F₂分离群体单株，对入选的3对引物进一步筛选，统计清晰可见的带数，结果（图1）证明E33/M50、E37/M47及E38/M48引物对扩增特异产物片断和Ps-2位点分离一致，经卡平方测验，不显著，说明它们与Ps-2位点紧密连锁，其出现的交换率分别为0.53、0.54和0.54。进一步利用JoinMap程序分析，结果表明E37/M47 、E38/M48及E33/M50与Ps-2可育基因的遗传图距分别是6.04cM、6.04cM、6.06cM，对应的LOD值分别为17.16、16.49、17.26。上述3个标记均位于可育基因的同一侧，位置基本相同，它们分别扩增出390bp、150bp和80bp的DNA片断。

表2 利用F₂分离群体获得的与Ps-2位点紧密连锁AFLP标记

Table 2 The obtained AFLP makers tightly linked with Ps-2 loci using F₂ segregation population

　

引物组合 Primer combinations	总带数 Total bands	可育有带 Fertile plants with bands	不育无带 Sterile plants without bands	可育无带 Fertile plants without bands	不育有带 Sterile plants with bands	x2测验 x2 Test	显著性 Significant
E33/M50	113	85	28	4	2	0.002	不显著 none significant
E37/M47	112	84	28	4	2	0.0	不显著none significant
E38/M48	110	83	27	4	2	0.12	不显著none significant

3. 讨论

目前已发现一系列番茄雄性不育类型，包括ms类型的花粉不育、sl类型的雄蕊退化、ps功能型不育等，其中ms、sl等不育类型不能产生100%的不育后代，保持较困难，而且会发生自交；功能型ps不育类型通常表现为花冠2/3～4/5和筒状雄蕊连生在一起，花瓣紧扣在花药的背沟中不能开放，花药一般不开裂，也妨碍了自花授粉；ex长柱头功能不育类型，不仅易出现自交，同样受环境影响较大，且种子产量较低^[1]。鉴于上述原因，该些材料均未被广泛应用于生产^{[1～3， 7]}。而含有ps-2基因不育系的最大优点是花药关闭，而花粉可育，可通过人工自交获得100%的不育后代，同时杂交制种时也可获得较高的种子产量^[3]。Atanassova等^[3]研究结果证明，虽然ps-2不育类型属于功能型不育，虽然也受环境和遗传背景条件的影响，但完全可以选育出稳定的100%不育后代。李君明等^[8，9]通过对相关不育材料在我国环境条件下观察发现，ps-2不育类型的不育性稳定，可用于杂交制种，而且杂种优势较强。但是在不育材料转育过程中，由于ps-2为单隐性基因，而且坐果受育性影响，获得综合性状优良的不育材料较为困难，通常需要较大的群体及投入大量的人工授粉等工作，这也是目前ps-2基因不能被广泛应用的重要原因之一。分子标记可极大地加速有益基因的遗传转育，Staniaszek等^[10]已获得了与番茄雄性不育ps基因连锁的RAPD标记并用于后代辅助选育和杂种纯度鉴定。目前还尚未有ps-2基因标记的报道，本文通过F₂分离群体获得了3个与可育Ps-2位点紧密连锁的标记，利用该些标记，采用反向选择策略，苗期可方便地获得后代含有ps-2基因的纯合不育材料，减少大量的田间筛选工作，为利用分子标记辅助选择技术选育不育后代材料打下了基础。由于AFLP操作比较复杂，将AFLP标记转化为简单快速、成本低、容易操作、特异性高的特异PCR标记已成为趋势^[11]。与番茄ps-2雄性不育基因紧密连锁的特异PCR标记的获得，必将为番茄育种者提供更为方便、可靠的检测手段。另外，Atanassova等^[12]通过形态标记，已将ps-2初步定位于第4条染色体，证明该基因和ful基因连锁，但图谱距离较大（约26cM），番茄已经构建了RFLP-AFLP整合连锁图谱^[4]，本研究获得的3个与Ps-2位点紧密连锁的AFLP标记，为进行ps-2不育基因的分子定位也奠定了良好的基础。

[1] Kallo G. Genetic improvement of tomato. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 1991, 256～287

[2] Atherton J G 编著. 郑光华, 沈征言 译. 番茄. 北京: 北京农业大学出版社, 1988, 89～94

[3] Atanassova B. Functional male sterility (ps-2) in tomato (Lycopesicon esculentum Mill.) and its application in breeding and hybrid seed production. Euphytica, 1999,107:13～21

[4] Haanstra, J P W., Wye C., Verbakel H. et al.. An integrated high-density RFLP-AFLP map of tomato based on two Lycopersicon esculentun×L.pennellii F₂ population. Theor. Appi. Genet. 1999,99:254～271

[5] Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res, 1995, 23 (21): 4407～4414.

[6] Bassam B J, Caetano Anollés G, Gresshoff P M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem ,1991,196: 80～83

[7] 邢虎成, 宋燕, 云兴福, 李君明, 周永健, 徐和金. 番茄雄性不育研究进展. 中国农学通报, 2004,20 (2): 157～160

[8] 李君明, Bistra Atanassova, 徐和金, 周永健, 杨宝军. 番茄ps-2雄性不育品系的初步观察. 园艺学报, 2001, (4):381～382.

[9] 李君明, 宋燕, 徐和金, 周永健, Bistra Atanassova. 番茄ps-2雄性不育系01222的育性观察. 中国农学通报, 2003,19(2): 16～18

[10] Staniaszek M, Marczewski W, Habdas H, and Potaczek H. Identification of RAPD markers linked to the ps gene and their usefulness for purity determination of breeding lines and F₁ tomato hybrids. Biotechnology and Physiology, 2000,22:303～306

[11] 庄南生，郑成木. 植物AFLP标记转化为特异PCR标记的研究进展. 华南热带农业大学学报, 2004,10(3): 11～14

[12] Atanassova B. Linkage studies of the “positional sterility-2” mutant in tomato, Journal Genetics and Breeding, 1991, 45: 293～296