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朱振东1
，霍云龙1,2，王晓鸣1，黄俊斌2，武小菲1 （1中国农业科学院作物科学研究所,
北京
100081; 2华中农业大学植物保护系,
武汉
430070） 摘要：
由大豆疫霉菌引起的大豆疫霉根腐病是大豆的毁灭性病害。该病已在我国主要大豆产区发生，在局部地区造成较大的产量损失。利用抗病品种是防治大豆疫霉根腐病最有效的方法。本研究目的是筛选大豆疫霉根腐病抗源，为病害防治和抗病品种的选育提供参考。用下胚轴创伤接种方法接种鉴定120个栽培大豆品种（系）对10个具有不同毒力大豆疫霉菌菌株的抗性。有110个品种（系）分别抗1-10个大豆疫霉菌菌株，其中以河南大豆品种（系）对疫霉菌的抗性最丰富，安徽、湖北和山西大豆品种（系）也具有丰富抗性多样性。120个大豆品种（系）对10个大豆疫霉菌菌株共产生57个反应型，有4个抗性反应型分别与单个抗病基因的反应型一致，有7个抗性反应型与2个已知基因组合的反应型相同，其他抗性反应型为新的类型。
一些大豆品种（系）中可能存在有效的抗大豆疫霉根腐病新基因。 关键词：大豆；疫霉根腐病；抗性；大豆疫霉菌；筛选 Screening for Resistance Sources to Phytophthora Root Rot in Soybean ZHU
Zhen-dong1, HUO Yun-long1,2, Wang Xiao-ming1,
HUANG Jun-bin2, WU Xiao-fei1 (1
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081; 2 Department of Plant Protection, Huazhong
Agricultural University, Wuhan 430070) Abstract:
Phytophthora
root rot, incited by Phytophthora sojae, is a destructive
disease of soybean. The disease has occurred in several
soybean-producing regions in China, and caused heavy losses in some
regions. Cultivar resistance has been the most effective way to
control Phytophthora root rot. The objective of this study was to
screen effective resistance sources to P. sojae for
disease control and resistance breeding. One
hundred and twenty soybean cultivars or lines from 11 provinces were
evaluated for their responses to 10 strains of P. sojae
using the hypocotyls inoculation technique. One hundred and ten
cultivars or lines were identified that confer resistant to one or
more of the 10 strains of the pathogen. The most abundant resistance
diversity was occurred in cultivars or lines from Henan province,
followed by from Anhui, Hubei and Shanxi province. One hundred and
twenty cultivars or lines elicited 57 different reaction types with
the 10 strains of the pathogen. There were 4 reaction types that are
consistent with the reaction patterns of a single gene， seven
reaction types are consistent with two-gene combinations, and the
others are novel reaction types. Some cultivars or lines possibly
carry novel Phytophthora resistance genes that are effective to
control Phytophthora root rot of soybean in China. Key
words: Soybean;
Phytophthora root rot; Resistance; Phytophthora sojae;
Screening 由大豆疫霉菌（Phytophthora
sojae Kaufmann &
Gerdemann）引起的大豆疫霉根腐病是严重影响大豆生产的毁灭性病害之一[1]。该病已在我国的一些大豆主要产区发生和为害，在局部地区造成较大产量损失[2，3]。由于其土居特性，只要条件适宜，大豆疫霉菌在大豆整个生育期都能侵染大豆并造成危害，导致早期大豆烂种、猝倒和中后期根、茎腐。虽然，一些杀菌剂如甲霜灵、霜脲青、杀毒矾等对大豆疫霉菌有较好的抑制作用，但这些杀菌剂药效期有限，均不能有效控制该病害的发生[4]。实践证明，防治该病惟一有效的方法是利用抗病品种。迄今为止，国外已鉴定出15个抗疫霉根腐病基因（Rps
基因），但这些抗病基因在我国还没有得到充分的评价和利用[5]。 自20世纪90年代中期以来，我国开展了大规模的抗大豆疫霉根腐病种质资源筛选[6，7]。但是，由于缺乏对大豆疫霉菌毒力结构的了解，抗性大豆种质资源筛选大多局限于对大豆疫霉菌1号小种抗性，筛选出的抗性种质不能有效地用于病害防治和育种。实际上，我国大豆疫霉菌毒力结构十分复杂，一些地区存在能够克服所有国外已知抗病基因的毒力型或毒力组合，而且不同地区大豆疫霉菌优势毒力存在差异[3]。因此，为了获得有效的抗病品种和抗源，对大豆种质资源进行抗大豆疫霉菌不同毒力型的评价和鉴定其抗病基因类型势在必行。本研究利用10个具有不同毒力的大豆疫霉菌接种鉴定120个大豆品种（系）的抗性，分析大豆品种（系）的抗病基因，旨在为大豆疫霉根腐病的防治和抗病品种的选育筛选有效的抗源。 1
材料与方法 1.1 材料 120个大豆品种（系）分别由广西自治区农科院经作所
、中国农科院油料所、安徽省农科院作物所、河南省农科院粮油所、河北省农科院粮油所、山东省农科院作物所、山西省农科院品资所和经作所、辽宁省农科院作物所、辽宁省铁岭大豆所、黑龙江省农科院大豆所和合江农科所、新疆农垦科学院和中国农科院作物科学研究所提供。含有不同抗大豆疫霉根腐病基因（Rps基因）的大豆品种（系）由美国俄亥俄州立大学Schmitthenner博士提供,本实验室繁殖和保存,
品种名称及所含抗病基因见表1。 1.2
大豆疫霉菌鉴别菌株 选择10个不同来源的大豆疫霉菌分离物用于本研究，其中分离物PsBra1和PsAm1由南京农业大学郑小波教授提供，USAR1由美国俄亥俄州立大学Schmitthenner博士提供，其他分离物由本实验室分离。分离物保存在DV8A（稀释V8汁琼脂）培养基，试验前转入胡萝卜琼脂（CA）培养基平板，在24℃培养复壮。为了保证分离物毒力的稳定性，对试验分离物建立单孢系。分离物在CA培养基中培养5～7d，取1.5cm×1.5cm的菌丝块菌面朝上放在直径6cm无菌培养皿中，加无菌水刚淹过菌丝块止，在24℃孵育诱导产生游动孢子囊。待游动孢子释放后，取游动孢子悬浮进行系列稀释，然后取500μl
涂抹选择性培养基（PBNIC）平板，
在24℃培养2～3d，挑取单菌落于1.5% CA培养基平板上扩繁。每个分离物选择3～5个单孢系进行毒力测定，根据毒力结果最终选择1个单孢系用于大豆品种（系）的抗性鉴定。 1.3 大豆品种（系）抗性鉴定 抗性鉴定苗期采用下胚轴创伤接种方法[8]。每个品种（系）分别取15粒播种于以蛭石为基质的直径为10
cm塑料花盆中，出苗前温室温度控制在25～29℃，出苗后温度控制在18～25℃，培养8～10d后，保留10株健康植株接种。接种方法为用注射器上针尖在大豆子叶下0.5cm处向下划约1cm长的伤口，然后将混匀的接种体注于伤口处。接种后在21～25℃条件下保湿48h，然后转入温室培养，5～6d进行病情调查。一个品种（系）如果有70%或以上的植株死亡则为感病（Susceptible，S），如有70%或以上植株正常生长则为抗病（Resistant，R），死亡植株在31%～69%的归为中间类型（Intermediate，I）。鉴定为抗病或中间类型的品种（系）进行2～3次重复鉴定。 2 结果与分析 2.1 大豆疫霉菌鉴别菌株的建立 通过分离单个游动孢子，建立了10个不同来源大豆疫霉菌分离物的单孢系。用13个含有已知抗大豆疫霉根腐病基因的大豆品种（系）对获得的单孢系进行毒力测定，根据毒力测定结果每个分离物最终选择的1单孢系作为鉴定大豆品种（系）抗病性的鉴别菌株。13个大豆鉴别品种对10个不同菌株的反应见表1。所选择的10个菌株能够有效地区分13个含有已知抗病基因的大豆鉴别品种（系），但所有菌株均对含有Rps5基因的大豆品系L85-3059有毒，因此不能将其与不含任何抗病基因的品种Williams分开。 2.2 大豆品种（系）抗性鉴定 用下胚珠创伤接种方法鉴定了120个大豆品种（系）对10个不同大豆疫霉菌菌株的抗性反应。图1显示了大豆品种（系）分别对10个菌株呈抗病反应的百分率，其中抗USRA1m菌株的品种（系）最多，为99个，占鉴定总数的82.2%，抗PSJN4m菌株的品种（系）最少，为39个，占32.5%。在鉴定的120个大豆品种（系）中有110个分别抗1～10个大豆疫霉菌菌株，占鉴定总数的97.7%。图2为大豆品种（系）抗不同数量菌株的统计，其中超过半数（55.0%）的大豆品种（系）抗5个以上菌株。表2为抗6～10个菌株的大豆品种（系）地理分布情况，结果表明河南大豆品种（系）对疫霉菌的抗性最丰富。在鉴定的10个河南品种（系）中，有7个品种抗所有10个菌株，占抗所有10个菌株品种数的58.3%，有2个品种分别抗9个和8个菌株。此外，安徽、湖北和山西大豆品种（系）也具有丰富抗性多样性。
图1
抗不同大豆疫霉菌菌株的大豆品种（系）数量 Fig.
1 Percentage of resistance cultivars or lines to different strains of
Phytophthora sojae 表1含已知抗病基因大豆品种或品系对10个大豆疫霉菌鉴别菌株的反应 Table 1 Differential reaction of soybean
cultivars/lines possessing Phytophthora resistance genes after
inoculation with 10 strains of Phytophthora sojae
a: R = 抗病，
S = 感病 a: R = resistant, S = susceptible
图2
抗不同大豆疫霉菌菌株数大豆品种（系）的数量 Fig.
2 Percentage of cultivars or lines resistant to different numbers of Phytophthora
sojae strains 表2抗6-10大豆疫霉菌菌株的大豆品种（系）分布 Table
2 Distribution of cultivars or lines from different provinces resistant
to 6–10 strains of Phytophthora sojae
a：括号内数据表示抗病品种占鉴定总数的百分率 a：The
data in parentheses is percentage of resistance cultivars or lines 将大豆品种（系）对大豆疫霉菌的中间反应类型（I）归为抗病反应，基于分别对10个大豆疫霉菌鉴别菌株的抗病（R）和感病（S）反应，120个大豆品种（系）共产生57个反应型（表3）。通过与13个含有已知抗病基因大豆品种（系）对10个大豆疫霉菌鉴别菌株的反应型比较，
分析大豆品种（系）可能含有的抗病基因或基因组合。有4个抗性反应型分别与单个抗病基因的反应型一致，有7个抗性反应型与2个已知基因组合的反应型相同，其他抗性反应型为新的类型。产生的反应型与2个单基因组合反应型相同的品种可能含有两个基因，也可能只含有一个未知的单基因。 抗10个大豆疫霉菌鉴别菌株的反应型RRRRRRRRRR发生在皖豆15、蒙9449、夏豆01-72、中豆32、豫豆15、豫豆19、豫豆24、郑92116、郑9525、郑97196、郑长交14青和鲁豆4号等12个品种（系），该反应型不符合任何一个已知单个基因的反应型，但与Rps3a与Rps1c或
Rps1k基因组合的反应型一致。抗9个菌株的大豆品种（系）共产生RRRRSRRRRR、RRSRRRRRRR和RSRRRRRRRR三个反应型，这3个反应型分别发生在汾豆58号、鉴30和晋遗29、豫豆25号、蒙9752和中豆20、汾豆56号和皖豆24号中，均不符合任何单个基因的反应型，但RRRRSRRRRR反应型符号Rps3a和Rps2、Rps6或Rps7基因组合及Rps3c和Rps6基因组合的反应型，RRSRRRRRRR反应型与Rps1a基因和Rps6基因组合的反应型一致，RSRRRRRRRR反应型相同于Rps1c与Rps4或
Rps6和Rps1k与Rps2、Rps4或Rps6的基因组合的反应型。抗8个菌株的品种（系）共产生8个反应型，其中RRRRSRRRSR、RRRSRRRRSR、RRRSRSRRRR、RRRSRRRSRR、RRRSSRRRSR和RSRRSRRRRR等6个反应型不同于任何单个基因或两个基因组合的反应型。RRSRRSRRRR
和RSRRRRRRSR反应型不同于任何单个基因的反应型，但RRSRRSRRRR反应型与Rps1a和Rps4基因组合的反应型一致，RSRRRRRRSR反应型和Rps1c与Rps2或Rps3b基因组合的反应型一致。有17个品种（系）抗10个菌株中的7个菌株，共产生8种反应型，其中有6种反应型不同于任何单个基因或两个基因组合的反应型，但皖豆21号的反应型RSSRRSRRRR与Rps4和Rps1b或Rps1d基因组合的反应型一致，
RSSRSRRRRR反应型与Rps6基因的反应型相同，也符合Rps4与Rps2或Rps7基因组合的反应型。 在其余的反应型中，有15个品种（系）抗6个菌株，共产生10种反应型，除晋遗35号、蒙9428、铁丰28号、铁丰29号和桂夏1号5个品种（系）产生的反应型RSSRSSRRRR与Rps4基因的相同外，其它9种反应型不同于任何单个基因或两个基因组合的反应型。抗5、4、3和2
个菌株的分别有6、7、10和4个品种（系）和产生4、6、8和2种反应型。只抗1个菌株的品种（系）有17个，产生6种反应型，其中反应型SSSSRSSSSS与Rps1d基因的反应型一致，反应型SSSSSSSSRS与Rps3b基因的反应型相符，这两个反应型分别发生在春湘105和中豆29中。 表3
120个大豆品种（系）对10个大豆疫霉菌菌株的反应型 Table 3
Reaction types of 120 cultivars or lines to 10 strains of Phytophthora
sojae
a一个品种（系）依次对大豆疫霉菌菌株USAR1m、PSBra1、PSAm1、PSXJ1、PSJN4m、PSMC1、PSZLT1m、PSFJ1、PSXJ2和41-1m的反应组合为反应型。 aThe reaction type a cultivar or
line occurred is a combination of reactions of the cultivar or line to
strains USAR1m,
PSBra1, PSAm1, PSXJ1, PSJN4m, PSMC1, PSZLT1m, PSFJ1、PSXJ2 and 41-1m in
their given order. 3 讨论 3.1 我国大豆抗疫霉根腐病资源的分布 我国为大豆的起源地，拥有丰富的大豆资源。国内外对我国大豆资源抗疫霉根腐病筛选结果均表明我国存在丰富抗性资源，但抗性资源丰富度和多样性在地理分布上存在差异。Lohnes等[9]评价了726份我国甘肃、山西、陕西、河北、山东、河南、宁夏、江苏和安徽等省份大豆资源对大豆疫霉菌1、3、7和25号生理小种的抗性，结果表明我国黄淮流域和长江流域的安徽、江苏、山东和河南4省存在高频率的抗疫霉根腐病大豆资源和极其丰富抗性多样性。Kyle等[10]利用10个大豆疫霉菌生理小种评价了引自我国安徽、广东、湖北、江苏、上海、四川和浙江等省共628份大豆种质资源抗病性，被鉴定资源普遍存在对大豆疫霉根腐病的抗性，其中以湖北、江苏和四川的资源抗性多样性最为丰富。王晓鸣等[7]对我国不同大豆生态区1000多份大豆种质资源进行了抗1号小种的鉴定，结果表明长江流域资源的抗性最高，其次是黄淮流域的资源，东北地区的种质抗性最差。在本研究中，我们对分别来自我国不同大豆生态区的11个省（区）的120个栽培品种（系）进行抗大豆疫霉根腐病的鉴定，结果表明河南品种（系）中存在最丰富的抗性多样性，安徽的品种（系）次之，此外，湖北和山西的品种（系）也具有丰富的抗性多样性。该研究结果再次证明我国黄淮流域和长江流域的大豆存在丰富的抗性多样性。因此，大豆抗疫霉根腐病资源的筛选该以这两个大豆生态区为主。 3.2 抗大豆疫霉根腐病资源的利用
大豆疫霉根腐病已经成为黑龙江省的重要大豆病害[2]。研究表明目前黑龙江省大豆疫霉菌主要以对Rps7、Rps3c、Rps1d、Rps3b和Rps5具有较高的毒力频率，而对Rps1k的毒力频率最低，其次是Rps1c[3]。因此，在黑龙江省抗大豆疫霉根腐病最有效的抗病基因是Rps1k，其次是Rps1c。对黑龙江省栽培大豆品种（系）抗大豆疫霉根腐病的鉴定结果表明，部分品种抗当前大豆疫霉菌优势毒力菌株，在生产上用于病害防治是有效的[11～13]。但黑龙江省有效抗病品种（系）抗性多样性低和遗传基础较窄，在培育抗病品种时应该利用黄淮流域和长江流域的优异抗性资源，如本研究中产生RRRRRRRRRR反应型、RSRRRRRRRR反应型和RSRRRRRRSR反应型的品种（系），这些品种（系）具有广谱抗性，可能含有Rps1k或Rps1c的基因组合，也可能含有新的抗病基因。 黄淮流域和长江流域存在复杂的大豆疫霉菌毒力组成[3]，但由于缺乏系统的研究，这两个大豆生态区大豆疫霉根腐病的危害情况还不清楚。虽然大豆根腐病长期以来一直是影响黄淮流域和长江流域大豆生产的重要病害，而由大豆疫霉菌引起的根腐病却没有引起广泛注意，其原因可能在于：（1）由于大豆疫霉菌分离和鉴定困难，一般条件下分离不到该菌而导致误诊；（2）栽培品种广泛存在抗性，有效控制了该病的流行。由于大豆疫霉菌存在，这两个大豆生产区就有病害发生的可能。事实上安徽的局部地区曾因大豆疫霉根腐病的严重为害而被迫放弃大豆种植。因此，为了预防和控制大豆疫霉根腐病的发生，在黄淮流域和长江流域有针对性地利用抗病品种是必要的。在黄淮流域，目前有效的抗病基因有Rps1k、Rps1a和Rps1c，产生RRRRRRRRRR反应型、RRSRRRRRRR反应型、RSRRRRRRRR反应型和RSRRRRRRSR反应型的品种（系）是有效的。在长江流域，大豆疫霉菌的毒力构成能够克服所有已知的抗病基因，因此必须利用新的抗病基因或基因组合，如本研究产生RRRRRRRRRR反应型的品种（系）是有效的。 致谢：广西自治区农科院经作所孙祖东研究员
、中国农科院油料所周新安研究员、安徽省农科院作物所张磊研究员、河南省农科院粮油所李卫东研究员、河北省农科院粮油所赵双进研究员、山东省农科院作物所徐冉研究员、山西省农科院品资所王志研究员和经作所刘学义研究员、辽宁省农科院作物所王文斌研究员、辽宁省铁岭大豆所傅连舜研究员、黑龙江省农科院大豆所于佰双研究员和合江农科所马淑梅研究员、新疆农垦科学院战勇先生、中国农科院作物科学研究所邱丽娟研究员为本研究提供大豆品种（系），在此表示衷心感谢！
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