黄淮麦区小麦品种（系）的ISSR位点遗传多样性分析

马艳明，李斯深，范玉顶，孙海艳，李永祥，李瑞军

（山东农业大学农学院，泰安 271018）

摘  要：选用11个ISSR引物，对黄淮麦区96个小麦推广品种（系）进行遗传多样性分析。共检测到96个多态性位点，每个引物多态性位点数平均为8.7个，变幅为3～23个；ISSR引物的多态性信息含量PIC变幅为0.601～0.941，平均0.791，表明ISSR具有较强的品种间区分能力，是研究小麦品种资源遗传多样性的有效分子标记技术之一。96个品种（系）间，Nei’s遗传相似系数变化范围为0.53～0.91，平均为0.60，品种间遗传相似性变幅较大，表明黄淮麦区不同小麦品种（系）间存在着不同程度的遗传多样性差异。根据品种间遗传相似系数聚类，96份材料被聚成8大类群，共14个亚类，类群与系谱和原产地无关。

关键词：小麦； ISSR；遗传多样性；聚类分析

Genetic Diversity of ISSR Loci for Wheat Cultivars of

Huang-Huai Winter Wheat Regio

MA Yan-ming, LI Si-shen, FAN, Yu-ding, SUN Hai-yan, LI Yong-xiang, LI Rui-jun   

( College of Agronomy, Agricultural University, Taian, shandong, 271018)

Abstract：ISSR (inter simple sequence repeat) markers were used to detected genetic diversity among wheat cultivars (or breeding lines) of Huang-Huai Winter Wheat Region of China. Totally 96 alleles of 11 ISSR markers were detected among 96 cultivars with the average of 8.7 alleles per ISSR marker, and the number of alleles per primer ranged from 3 to 23. The value of allelic polymorphism information content (PIC) ranged from 0.601 to 0.941, on an average, 0.791 per primer. These results showed that ISSR is a suitable molecular technique for genetic diversity analysis of wheat germplasm resource. The value of Nei’s genetic similarity (GS) indexes of 96 cultivars based on the ISSR data varied from 0.35 to 0.91, with an average of 0.60, indicating that the genetic diversity among cultivars of Huang-Huai Wheat Region is abundant. Cluster analysis showed that the cultivars tested in this study could be clustered into eight groups and fourteen sub-groups, which generally do not agree with pedigree relations and regions of origin.

Key words: Wheat; ISSR; Genetic diversity; Cluster analysis

 

小麦是我国第二大粮食作物，黄淮冬麦区是我国最主要的小麦产区，常年小麦种植面积达1,133万公顷，约占全国小麦种植面积的40%，总产量达全国小麦总产量的45%左右。一些学者深刻认识到要继续提高小麦的育种水平，必须提高育种基础材料的遗传多样性^[1]。刘三才等^[2]分析了地方品种和选育品种两个类型种质资源的遗传多样性，表明我国小麦选育品种和地方品种在15个主要性状上都存在较广泛的遗传多样性，选育品种与地方品种相比遗传多样性总体上略有降低，但遗传变异方向有很大的不同。马艳明等^[3]以黄淮麦区 100个小麦品种 （系） 为材料，对19个有关蛋白质品质和淀粉品质性状进行了多样性分析，表明育成品种（系）品质性状存在较丰富的遗传多样性。目前，尚缺乏黄淮麦区育成品种（系）多样性的分子标记分析。

ISSR是基于SSR发展起来的一种分子标记技术，其引物是根据基因组中微卫星序列设计的含锚定碱基的寡聚核苷酸链，长度大都在15～24bp，反应退火温度较高，引物－模板复合物较稳定，

扩增产物很少受反应体系中随机因素的影响，也很少因退火温度小范围内的变动而有大的差异，实验稳定性较好。在遗传多样性研究方面，由于SSR在真核生物中的分布非常普遍，并且进化变异速度非常快，因而锚定引物的ISSR-PCR也可以检测基因组许多位点的差异，现在已开始用于作物的遗传多样性研究中^[4~7]，但在小麦中尚罕见报道。本文试图通过ISSR分子标记分析，了解黄淮麦区主要推广品种（系）的遗传多样性，为小麦品种的改良提供参考。

1 材料与方法

1.1供试材料

材料为黄淮麦区近年推广品种（系）96个（表1）。

表1 供试材料品种名称

Table 1 Names of the wheat cultivars used in this study

 

1.2 DNA提取

采用Devos等^[8]的酚－氯仿法提取DNA。

1.3 PCR分析

根据Nagaoka等^[9] 的33个ISSR引物序列，由上海生工公司合成。PCR反应总体系为20µl，其中10× buffer 2.0µl，引物 （10pmol/µl）1.0µl，Mg²⁺ （25mM）1.6µl，Tap酶 （5u/µl）0.2µl，dNTP（2.5mM）0.8µl，模板DNA（30ng/µl）2.0µl，ddH₂O 12.4µl。PCR扩增条件为94℃变性7 min后进入循环，循环程序为：94℃变性30s，50-60℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环，循环完成后72℃延伸7min。扩增产物用4.5 ％变性聚丙烯酰铵凝胶电泳检测。

1.4统计分析方法

遗传多样性分析采用国际上通用的多态性信息量（Polymorphism Information Content，PIC）。PIC是指一个标记依靠其可检测的等位基因数和它们的分布频率，从而得到该标记在一个群体中检测的多态性大小值。PIC值按照Anderson^[10]的方法计算，对于标记i的PIC值计算公式为：

          PIC_i＝1-∑P_ij²

                          ^j=1

其中：P_ij表示标记i的第j个带型出现的频率，标记i的总带型从1到n。PIC值的大小在0~1之间，0表示无多态性，l表示具有非常高的多态性。

遗传距离的分析采用0～l系统记录谱带位置，在相同迁移位置有带记为1，无带记为 0。按Nei and Li^[11]的方法计算材料间遗传相似系数（GS），GS=2N_ij/(N_i+N_j)，其中，Ni 代表第i个品种的扩增带纹数目，Nj代表第j个品种的扩增带纹数目，Nij代表第i、j个品种间共有的带纹数目。根据GS值以不加权成对算术平均法UPGMA进行聚类，建立遗传相似系数聚类图。所用分析软件为NTSYS2.1。

2 结果与分析

2.1  ISSR标记的多态性

用Nagaoka等^[9]的33个ISSR引物进行PCR扩增，其中11个引物扩增效果较好（表2）。用11个ISSR引物，对属于黄淮麦区的96个小麦品种进行了分析，共检测到96个等位变异，引物等位位点数在3～23个之间，平均每个位点出现8.7个等位变异。引物UBC873的等位位点数最多。图1为引物UBC815的PCR扩增结果。引物等位位点多态性信息含量PIC变幅为0.601～0.941，平均0.791（表2）。以引物UBC873值最高（0.941），引物UBC825值最低（0.601）。从表中还可看出，位点多态信息含量与等位变异数不尽一致。

表2  11个ISSR标记检测到的等位变异数及其多态性信息量（PIC）

Table 2 Number of alleles and PIC values of 11 ISSR markers

 

图1 利用ISSR引物UBC815对27个品种（系）的扩增结果

Fig. 1 A PCR profile reaction using UBC819 marker for 27 wheat cultivars

1. 陕优225；2. 4582；3. 济南19；4. 淄麦12；5. 烟优361；6. 中优9507；7. 小偃6号；8. PH691；10. 陕623；11. 百农8717；12. 山农92000；13. 烟1601；14. 抗倒680；15. 山农90485；16. 烟农15；17. D778；18. 济南16；19. 烟2070；20. 鲁麦21；21. 泰山241；22. 泰山021；23. 白玉149；24. 陕354；25. 6115-6-5；26. 晋麦30；27. J237

 

2.2遗传差异

根据ISSR多态性计算材料间的Nel’s遗传相似系数，96个品种间的遗传相似系数变化范围为0.35到0.91，平均为0.60，遗传相似性变化较大。在这些品种中，温县4号与豫麦34号间的遗传相似性最高，遗传相似系数（GS）值高达0.91。GS值大于0.8的有：小偃6号与PH691，晋麦30号与陕354，GS值为0.81；PH92006与PH85-4，GS值为0.82；J237与6115-6-5，GS值为0.85；PH92006与D9401，GS值为0.88。表明这些品种之间遗传相似性较高。鲁麦1号与烟475、鲁麦1号与烟1619间的遗传相似性最低，GS值仅0.35。GS值小于0.4的有：鲁麦1号与泰山241，GS值为0.37；冀956203与泰山241，GS值为0.38。

2.3 聚类分析

利用ISSR遗传相似性矩阵按UPGMA方法进行聚类分析，构建了各供试品种的亲缘关系图（图2）。在遗传相似系数0.53～0.91范围内的聚类结果显示，11个ISSR引物能将96个品种分开。依据遗传相似性程度，96份品种可分为8大类群，共14个亚类。

第I类群：可分为2个亚类，共包括15个品种。第1亚类，包括9个品种，其中山东品种有泰山288、山农92000、鲁麦23号、鲁麦22号和玉龙900；河南品种有周88114、温县4号、豫麦24号；山西品种有临远965186。第2亚类，包括6个品种，中优9507、冀5418、抗倒680、6115-6-5、J237及临抗1号。

第II类群：可分为10个亚类，包括62个品种，是最大的一个类群。第1亚类，共有9个品种。其中，济麦20、4072、鲁麦3号、鲁麦21号、泰山036、烟2070为山东的品种；冀审5099为河北的品种；偃展1号和豫展1号为河南的品种。第2亚类：包括6个品种。其中，烟辐188、烟1619、烟优361、山农830035为山东品种；西安168为陕西品种；百农3217为河南品种。第3亚类，有6个品种，即PH85-4、PH92006、PH1521、PH151、PH82-2-2和D9401（PH85-4选系），全部是山东农业大学培育的PH系列，均具有长穗偃麦草血缘。第4亚类，包括5个品种：D241、龙口8017-2、C98、烟103、稳千1号，全部是山东品种。第5亚类，有7个品种。包括有亲缘关系的陕优225、小偃6号、豫麦34号、PH691，还包括山东的泰山269、4582、D778 3个品种。第6亚类，仅有2个品种：山农921842和D672。第7亚类，包括的6个品种全部是山东的：烟85722、烟农15号、泰山008、烟475、滨麦3号和60336。第8亚类，包括8个品种，其中，7个山东品种：潍麦7号、烟239、烟2801、烟1601、鲁麦14号、莱州95021及济南19号；1个河南品种周麦12号。第9亚类，包括6个品种：山东的鲁麦1号、山农483、泰山079、莱州953、鲁麦11号；陕西的陕7859；河南的豫麦21号。第10亚类，有6个品种：临资9号、泰山201、鲁麦15号、陕623、陕354、晋麦30号。

第III类群：包括泰山97-1和兰考906两个品种，都是大穗型品种。

第IV类群：可分为两个亚类，共8个品种。第1亚类，包括山农90485、百农8717、白玉149、豫麦2号、郑州8603等5个品种。第2亚类，有淄麦12号、泰山021和泰山241等3个品种，都来自山东。

第V类群：包括临旱488、8033、鲁麦1号、泰山187、鲁麦18号、鲁215953等6个品种。

第VI类群：仅济南16号 一个品种。

第VII类群：仅冀956203一个品种。

第VIII类群：仅驻90-14一个品种。

从上述结果来看，除第II类群的个别亚类外，聚类状况与材料来源地没有必然联系。作者还就所选材料的系谱关系（未列出）与遗传相似性聚类结果进行了比较，表明两者之间也无必然联系。

3讨论

陈新民等^[12]用59 对SSR 引物对48 个优质冬小麦品种（系） 进行分析，检测出209个等位位点，引物等位点数在2～9个之间，平均每个引物为3.5个。引物等位位点多态性信息含量PIC变幅为0.16～0.87，平均0.56。倪中福等^[13]采用23对SSR引物对我国6个春小麦品种（系）及17个冬小麦品种（系）D染色体组的遗传多样性进行了分析，共扩增出65个等位基因，平均每个引物为2.9个。本研究中，11个ISSR引物在96份材料中共检测到96个多态性位点，引物多态性位点数在3～23个之间，平均8.7个，明显高于SSR标记；引物多态性信息含量PIC变幅为0.601～0.941，平均为0.791，同样较高，聚类结果显示11个引物可将96个品种（系）全部区分开来，表明ISSR标记具有较高的多态性，可有效反映品种（系）间的遗传差异。杜金昆等^[14]对我国普通小麦、斯卑尔脱小麦、密穗小麦和轮回选择后代共47份材料进行了ISSR分析，表明ISSR具有较高的多态性，每个引物可以扩增出11~38 条多态性带，平均为18.8条。因此，ISSR是研究小麦品种资源遗传多样性的有效分子标记技术之一。

对主要育种材料间的遗传多样性进行研究，可直接聚合目标农艺性状，减少研究材料的数量，提高育种效率，从而加快育种进程^[15]。本研究根据各品种间ISSR标记揭示的遗传相似系数，将96个品种聚成8个类群，14个亚类。但结果显示聚类状况与系谱和来源地没有必然的联系。这可能是由于小麦育种资源交流的日趋频繁，导致品种的地域性程度降低。因此本研究结果在一定程度上是对目前小麦遗传资源利用状况的客观反映。结果显示，96个品种（系）的遗传相似系数变化范围为0.35～0.91，平均值达0.60，品种间遗传相似性程度变幅较大；并且，第II亚类品种数多达62个，占64.6%。又表明整体水平上品种间具有较大的遗传相似性，遗传背景相对单一。亟需扩大不同来源种质资源的利用，改善育成品种的多样性。

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