形态与分子标记用于石刁柏种质资源遗传多样性的研究

李可峰^1，3，韩太利²，董贵俊⁴，刘杰⁴

(¹山东师范大学，济南 250014；²潍坊市农业科学院蔬菜研究所，潍坊  261041；

³ 山东体育学院，济南  250014； ⁴中国科学院植物研究所，北京 100093)

摘要：采用RAPD分子标记结合形态学指标对43份石刁柏种质的遗传多样性进行评价。田间试验相关分析表明，茎粗、株高和茎数与产量均呈极显著正相关，三者是影响石刁柏产量的主要因素。茎粗、株高、产量与一级笋率显著正相关，花梗全紫的石刁柏一级笋率相对较高。根据形态学指标将材料分为七大类。在分子标记中，从60个随机引物中筛选出12个能产生清晰、稳定可重复DNA片段的引物，对供试材料进行RAPD扩增。在供试材料中共获得183条扩增产物，产生的DNA片段大小主要分布在200~1600bp之间，其中170条具有遗传多态性，约占总数的92.92%。各基因型间的Nei氏相似性系数分布在0.407~0.931之间，平均相似性为0.765，可见石刁柏各基因型之间的遗传多态性较为丰富。经UPGMA方法建立树状图，可将参试品种划分为8大类群。形态学指标与遗传多样性指标的相关分析结果显示：分枝节间距、花梗颜色、每簇拟叶数、最长分枝长度、茎粗5个形态学指标与遗传多样性指标之间存在一定的相关性。

关键词：石刁柏；RAPD；形态标记；遗传多样性

Genetic Diversity of Asparagus (Asparagus officinalis L.) Cultivars Detected by Morphological and Molecular Markers

LI Ke-feng^{1, 3}, HAN Tai-li², DONG Gui-jun⁴, LIU Jie⁴

(¹Shandong Normal University， Jinan  250014 ； ²Vegetable Research Institute, Weifang Academy of Agricultural Sciences, Weifang  261041, Shandong; ³ Shandong Institute of Physical Education and Sport，Jinan  250014; ⁴ Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)

Abstract: RAPD and morphological analysis were carried out on 43 asparagus (Asparagus officinalis L.) cultivars. The diameter, height and number of stems are essential characteristics in the yield and quality evaluation of asparagus. The yield is positively correlated with the diameter, height and number of stems. At the same time, the ratio of the first-class spears is positively correlated with the diameter, height and yield of stems, and genotype with purple peduncle can produce more superior spears. These cultivars were clustered to seven groups by morphological analysis. The fingerprints of 43 asparagus genotypes were generated using RAPD method. Twelve primers were screened from 60 ten-bp arbitrary primers, and a total of 183 DNA fragments were amplified ranging from 200bp to 1600bp, among which 170 (92.92%) were polymorphic. The result of genetic similarity analysis for 43 asparagus genotypes showed that the Nei’s coefficient ranged from 0.407 to 0.931, and the average Nei’s coefficient was 0.765, suggesting that there was a rich genetic polymorphism among them. A DNA molecular dendrogram was established for 43 genotypes based on UPGMA cluster analysis of 183 DNA bands amplified by 12 primers, which divided them into eight groups. The correlation analysis between morphological and RAPD data showed that there were some correlation between internode length, phylloclades number, peduncle color, stem diameter, length of the longest ramification and index of genetic diversity.

Key words: Asparagus officinalis L.; RAPD; Morphological markers; Genetic diversity

石刁柏(Asparagus officinalis L.)又称芦笋，隶属百合科天门冬属，是一种重要的多年生药食兼用植物。近年来世界各国均有栽培，其育种研究得到快速发展，单交种、双交种、三交种、无性系杂交种、全雄杂交种、多倍体石刁柏等新品种不断涌现。石刁柏为多年生作物，一次种植多年采收，品种好坏直接影响多年生长周期的产量和品质。种质资源是产生优良品种的基础，对石刁柏种质资源的收集、整理、保存和深入研究，已成为石刁柏育种学家的紧迫任务。已有学者运用形态学标记和生化标记在石刁柏亲缘关系分析和种质资源鉴定等方面做了一些工作^[1～7]。分子标记（Molecular marker）以其快速、准确、所提供的信息量大、不受环境影响等特点，已广泛应用于遗传学评价、目的基因定位和遗传图谱的构建等领域。前人在石刁柏目的基因定位和遗传图谱的构建等方面做了大量工作^[8～12]，但在石刁柏种质资源的收集整理、保存和遗传学评价等基础研究方面，目前尚缺乏系统分析。随着人民生活水平的迅速提高，对石刁柏产品的需求日益增加，供需矛盾益加明显，加快自有新品种的育种研究已成为生产上的迫切需求。本研究采用分子标记与传统形态学评价相结合的研究策略，对40多份石刁柏种质进行初步遗传变异分析，以期为石刁柏品种的选育和种质资源合理利用提供依据。

1      \    材料与方法

1.1          供试材料

本实验材料共43份，42份（Ao1～Ao42）取自潍坊市农科院实验农场，1份（Ao43）取自中国科学院植物研究所植物园实验地。供试材料情况见表1。

表 1   供试材料及其来源

Table 1  Materials and their origins

1.2          实验方法

1.2.1          田间性状测定及数据分析  材料Ao1～Ao42种于潍坊市农科院实验农场（鉴于形态学标记具有易受环境影响的缺陷，Ao43不参加田间性状测定）。实验小区共3.4亩，采用随机区组设计，3次重复，株距为25cm，行距1.8m。于2001—2003年观察记录不同材料整个生长发育期间的相关形态学性状，选取如下11个指标：茎粗、第一分枝高度、株高、第一分枝高度/株高、最长分枝长度、分枝节间距、花梗颜色、每簇拟叶数、茎数、产量、一级笋率。为便于进一步统计分析，将花梗颜色性状按全紫赋值为0、半紫半绿（以花梗关节为界）赋值为1；每簇拟叶数按综合评分法编码^[13]，评分标准是：3拟叶，1；4拟叶，2；5拟叶，3；6拟叶，4；7拟叶，5；8拟叶，6。原始数据标准化后利用SPSS FOR WINDOWS （Version 10.0）软件进行相关、聚类分析。

1.2.2 供试材料间分子多态性和数据分析  分别剪取不同石刁柏基因型雄株幼嫩拟叶2g提取基因组DNA作为模板，提取参照Rogers和Bendich^[14]的CTAB法。DNA纯化后用含0.5μg/mL溴化乙锭的0.8%琼脂糖电泳检测，将DNA浓度平衡至20ng/μL。PCR反应体系如下：20ng/μL模板DNA 1μL，10pm/μL随机引物2μL (上海生工生物公司)，1U Taq Plus DNA Polymerase(天根生化科技公司)，10×反应缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8.4，200 mM KCl，15 mM MgCl₂，天根生化科技公司) 2μL，dNTP 混合液(2.5 Mm each) 1μL(大连宝生物公司),加ddH₂O至终体积20μL。扩增反应在PTC-100 PCR仪中进行，扩增程序为：94℃ 30 s，35℃ 10 s循环2次；50℃ 1 s，72℃ 45 s，94℃ 5 s，35℃30 s 循环38次；最后72℃ 延伸10 min。扩增产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳(电泳缓冲液为1×TAE)，溴化乙锭染色后用紫外凝胶成像仪观察照相。用100bp DNA Ladder Marker作分子量标记，每个样品的扩增带按有或无记录，有赋值为1，无赋值为0，得到原始数据矩阵。用NTSYS-pc软件(Version 2.00)计算基因型间的Nei氏遗传相似系数，按非加权配对算术平均法(UPGMA)建立各基因型间的聚类图。

2           结果与分析

2.1          相关分析

对石刁柏的11个农艺性状进行相关性分析（表2），发现石刁柏产量与茎粗、株高和茎数3个性状均呈极显著正相关，相关系数依次为0.545、0.791、0.713，可见茎粗、株高和茎数是影响石刁柏产量的主要因素。茎粗和株高与一级笋率极显著正相关，相关系数分别为0.425、0.421，产量与一级笋率显著正相关，相关系数为0.395，说明一级笋率与茎粗、株高、产量具有相同的变化趋势。但是一级笋率却与花梗颜色呈显著负相关，相关系数为-0.394。除产量和一级笋率外，与株高呈极显著正相关的有茎粗、第一分枝高度、茎数。每簇拟叶数与株高和第一分枝高度均呈显著负相关。另外，茎粗与第一分枝高度呈显著正相关（0.345），说明石刁柏茎越粗，第一分枝越高。花梗颜色与茎粗呈极显著负相关，表明花梗全紫的石刁柏茎粗，而花梗半紫半绿的石刁柏茎相对较细。

表2 石刁柏11个数量性状的相关分析

Table 2 Correlation analysis among morphological characteristics of A. officinalis

X₁，茎粗；X₂，第一分枝高度；X₃，株高；X₄，第一分枝高度/株高；X₅，最长分枝长度；X₆，分枝节间距；X₇，花梗颜色；X₈，每簇拟叶数；X₉，茎数；X₁₀，产量；X₁₁，一级笋率

* 和 ** 分别代表在0.05和0.01水平上的差异显著性

X₁, Diameter of stem; X₂, Height of the first ramification; X₃, Height of stem; X₄, Height of the first ramification / height of stem; X₅, Length of the longest ramification; X₆,Internode length;X₇, Peduncle color; X₈, Phylloclades number; X₉, Number of stems; X₁₀, Yield; X₁₁, The ratio of the first-class spears

* and ** stand for significant at 0.05 and 0.01 level , respectively

2.2          田间形态学聚类分析

以11个形态指标作为原始数据，标准化后计算石刁柏品种间（OUT）的欧氏距离，对得到的距离矩阵采用完全连接法（Furthest neighbor）进行聚类分析，建立亲缘关系树图（图1）。42份材料（Ao43除外）可聚为七大类：第 I 大类包括Ao1、Ao41、Ao15、Ao30、Ao40、Ao38、Ao39、Ao33、Ao2、Ao18、Ao5共11份材料，具有第一分枝高度/株高比例较大，每簇拟叶数为3或5，茎数较多等共同特点；第 II 大类包括Ao13、Ao14、Ao7、Ao12、Ao26、Ao29、Ao24、Ao36、Ao23、Ao35、Ao27、Ao34、Ao25、Ao42，具有产量相对较高、一级笋率较高、茎较粗、株高相对较高、除Ao7外均为全雄品系等共同特点；第 III 大类包括Ao22、Ao28，在43个基因型中产量最高；第 IV 大类包括Ao31、Ao37、Ao6，均为美国品种，产量、一级笋率较低，每簇拟叶数变化较大， 3至7枚均存在；第 V 大类包括Ao10、Ao16、Ao9、Ao11、Ao8、Ao3，一级笋率较低（除Ao16外），每簇拟叶数在3-5个，以4为主；第 VI 大类包括Ao20、Ao32、Ao4、Ao19、Ao21，前三者为紫芦笋，嫩茎粗大，一级笋率高，花梗全为紫色；Ao17独自为第 VII 大类，第一分枝高度较低、每簇拟叶数在5-8枚之间，以6、7居多，整个株型较小，拟叶偏多。

图1  42份石刁柏材料的形态数据聚类图

Fig.1  Morphological dendrogram of 42 asparagus materials from cluster analysis

2.3          RAPD分析

2.3.1          RAPD扩增结果  从60个随机引物中筛选出12个能产生清晰、稳定可重复DNA片段的引物，用以对供试材料进行RAPD扩增。在供试材料中共获得183条扩增产物，产生的DNA片段大小主要分布在200~1600bp之间；其中170条具有遗传多态性，约占总数的92.92%；平均每个引物扩增的DNA带数超过15条，多态性带超过14(表3)。各基因型间的相似性系数分布在0.407~0.931之间，平均相似性为0.765，其中0.7~0.8和0.8~0.9范围内的遗传相似性系数分别占总数的44.65%、38.49%。以上结果显示石刁柏基因型之间遗传多态性较高。图2为引物S1对43个不同石刁柏基因型进行PCR扩增所产生的基因组DNA指纹图谱。

图2  43个石刁柏基因型的基因组DNA指纹图谱

Fig. 2  Genomic DNA fingerprints of 43 genotype of asparagus

表3  12个有效引物在43份石刁柏材料上的扩增情况

Table 3  Amplications of 12 effective primers on 43 asparagus genotypes

2.3.2          石刁柏基因型的聚类分析  经UPGMA方法建立树状图(图3)，可将参试品种划分为8大类群。

图 3  RAPD标记产生的43份石刁柏材料聚类图

Fig.3  Dendrogram of 43 asparagus genotype from cluster analysis (UPGMA) with RAPD markers

从聚类图中可以看出，第 I 大类群可分为2个亚群，Ao43独为一个亚群，其余为第二个亚群。根据材料的地理来源可以看出，RAPD的聚类结果能在一定程度上反应材料间的地理关系。比如，来源于法国的Ao16和Ao17首先聚类，相似性系数高达0.931；美国所培育的全雄杂交种Ao10、Ao11、Ao13、Ao15、Ao14也聚为一类，其相似性系数为0.847~0.908，平均相似性系数为0.876。德国品种Ao26和Ao27相似性系数为0.918，Ao29和Ao30相似性系数为0.911分别聚成小类后再聚成一类，它们均为全雄株，前三者具有产量相对较高、一级笋率较高、茎较粗、株高相对较高的特点。来自美国的Ao6、Ao7、Ao8、Ao9平均相似性系数为0.856，也在第二个亚群中聚为一个小群。另外，Ao1和Ao40聚为一个小类，相似性系数为0.872，亲缘关系很近，这与Ao40为Ao1的后代相符。来自于不同国家的Ao23、Ao28、Ao19、Ao16、Ao17、Ao35、Ao20、Ao21、Ao22表现出与一些美国、德国品种很高的遗传相似性。Ao19(新西兰)与Ao14(美国)(相似性系数为0.913)聚为小类后与法国的Ao16，Ao17相聚，再与美国的一些全雄杂交种相聚，表现出很高的遗传相似性(平均相似性系数为0.880)。意大利的Ao35与德国的Ao29、Ao30(遗传相似性分别为0.875、0.883)亲缘关系比较接近。Ao20(新西兰)、Ao21(西班牙)、Ao22(荷兰)聚为一小类后，与美国、德国等国家的品种聚在第 I 大类群。

第 II 大类群也分为两个亚群。Ao3、Ao25和Ao12为第一亚群。Ao3为美国的一个双交种，Ao25和Ao12分别来自于荷兰和美国，二者均为全雄杂交种。第二亚群包括Ao31、Ao38、Ao39、Ao32、Ao34、Ao33 6个基因型，遗传相似性系数分别在0.765~0.867之间，变异幅度为0.102，平均相似性系数为0.817。

Ao35、Ao34和Ao36均为来自于意大利的全雄品系，但前两者分别在第 I 、 II 大类群，Ao36独为第 V 类群，说明意大利所培育的这3个杂交种遗传多样性相对比较丰富。与此类似，在荷兰培育的4个全雄杂交种中，Ao23和Ao22在第 I 大类群，二者的遗传相似性为0.782，与平均相似性系数0.765接近，其余两个杂交种Ao25和Ao24则分别位于第 II 、 IV 大类群。

UC800是我国南北各地目前的主栽品种之一。Ao38、Ao39和Ao37为美国不同育种公司生产的UC800品种。从理论上讲，同一品种遗传相似性应该很高，但聚类分析发现只Ao38和 Ao39(遗传相似性系数为0.810)聚为一类，而Ao37竟独为第 VII 大类群，与前两者的遗传相似性分别为0.703、0.707，均低于平均相似性系数0.765。

另外Ao4、Ao42、Ao18分别单独聚为 III 、 VI 、 VIII 类群。Ao4是由美国加里福尼亚石刁柏种子公司育成的第一个四倍体紫芦笋品种，嫩茎比一般二倍体种粗大，紫罗兰色，生食口感极佳，90年代初推广以后已成为一种高级生食蔬菜品种。Ao18是1994年由新西兰推出的一个无性系杂交种，出芽早，耐寒，在土壤温度为8.5℃时便开始萌芽(其余的一般高于10℃)。

2.4          形态指标与遗传多样性指标的相关性

43个石刁柏基因型的11个形态指标依次为茎粗（X₁）、第一分枝高度（X₂）、株高（X₃）、第一分枝高度/株高（X₄）、最长分枝长度（X₅）、分枝节间距（X₆）、花梗颜色（X₇）、每簇拟叶数（X₈）、茎数（X₉）、产量（X₁₀）、一级笋率（X₁₁），3个遗传多样性指标表示为Y₁（多态位点百分数）、Y₂（特有带百分数）、Y₃（遗传距离），其偏相关系数见表4。结果表明，多态位点百分数与分枝节间距和每簇拟叶数均呈显著正相关，偏相关系数分别为0.4231、0.4082。特有带百分数与茎粗呈极显著正相关（0.5241），与花梗颜色显著相关（0.4588），但与最长分枝长度显著负相关（-0.4542），说明特有带百分数与茎粗和花梗颜色存在相同的变化趋势，而与最长分枝长度存在相反的变化趋势。遗传距离与茎粗、最长分枝长度和花梗颜色也存在一定的相关性，其偏相关系数分别为0.4515、0.4760、-0.3868，说明茎越粗、分枝越长的石刁柏，其遗传多样性越大，花梗全紫的紫芦笋比绿芦笋和白芦笋遗传多样性大。

表4  11个形态学性状指标与遗传多样性指标的相关性

Table 4  Correlation coefficients between genetic diversity and morphology

* 和 **分别代表在0.05和0.01水平上的差异显著性

* and ** stand for significant at 0.05 and 0.01 level , respectively

3           讨论

3.1          田间形态学性状相关分析

产量和一级笋率是评价石刁柏质量的重要指标。田间实验相关分析表明：石刁柏产量与茎粗、株高和茎数均呈极显著正相关，相关系数依次为0.545、0.791、0.713，茎粗、株高和茎数是影响石刁柏产量的3个主要因素。茎粗、株高和茎数三者的乘积作为生育指数可估测翌年的产量，一般当年生育指数愈高，翌年产量也愈高，反之就低。另外，茎粗、株高、产量3个变量与一级笋率显著相关，相关系数分别为0.425、0.421、0.395，说明一级笋率与茎粗、株高、产量具有相同的变化趋势，茎越粗，植株越高，产量越高，一级笋率也越高。但一级笋率却与花梗颜色呈显著负相关，即花梗全紫的石刁柏一级笋率高，而花梗半紫半绿的石刁柏一级笋率不及前者，这是因为花梗全紫的石刁柏绝大部分为紫芦笋，在实际生产中紫芦笋的茎一般粗于绿笋和白笋，因此一级笋率相对较高。茎粗、植株高度、茎数构成石刁柏产量、品质特性，因此品种选育时要综合考虑3个性状的影响，将提高石刁柏产量与品质结合起来。

3.2          形态学与分子标记聚类结果比较

在石刁柏种质资源的收集、整理、评价研究以及今后的种质资源数据库建设中，形态学指标是一类重要的数据资料。特别是在开展石刁柏种质资源研究的起步阶段，积累相关的形态学资料是应用分子生物学技术加速石刁柏种质改良的基础。同时，由于分子标记遗传位点多、多态性高，已成为理想的标记方式。1998年，Hollingsworth等^[15]运用RAPD尝试对6个石刁柏栽培种进行多态性的鉴定，结果显示RAPD可应用于鉴定各品种的遗传变异。本研究采用形态学指标和分子标记所进行的聚类分析表明，形态学聚类结果与分子聚类结果既有重叠，又有不同。例如Ao1、Ao2、Ao5、Ao15、Ao30、Ao40、Ao41在形态和分子聚类结果中均聚到同一大类（第 I 大类群）；Ao33、Ao38和Ao39虽分布在两大聚类图不同的大类群中，但三者聚类结果比较相似。从整体来看，分子聚类与形态聚类结果又有许多差异。比如，Ao16和Ao17在分子聚类图中最先聚类，而在形态聚类图中二者被分到不同的类群当中，并且Ao17是单独聚类。产生这种结果的原因可能是因为形态学聚类的原始数据随环境因素不同易出现变化，如土壤肥力直接影响株高、茎数等形态学指标，而且在数据采集过程中人为因素也会产生一些干扰，因此有些情况下形态学标记并不能完全真实反映物种的遗传多样性。分子标记是以整个基因组为研究对象，不受环境影响，相对比较稳定，因此形态与分子聚类结果不可能完全吻合。但分子标记与形态特征具有一定的相关性，可以辅助选择用于石刁柏种质评价的有用的形态学指标。茎粗与遗传多样性指标的相关性进一步验证了它在石刁柏种质遗传评估研究中的重要地位。同时偏相关分析也表明，对石刁柏种质进行遗传评估时，分枝节间距、花梗颜色、每簇拟叶数和最长分枝长度也应该成为考察重点。

参考文献

[1]       Roux L, Roux Y. Identification biochimique de clones et de lignées d'asperge (Asparagus officinalis L.. Liliacees). Agronomie, 1981, 1: 541~548

[2]       Roux L, Roux Y. Identification biochimique de clones et de lignées d'asperge II. Caractères particuliers liés à l'état homozygote ou hétérozygote. Agronomie, 1983a, 3: 57~66

[3]       Roux L, Roux Y. Identification biochimique de clones et de lignées d'asperge, II. Caractérisation des hybrides de clones hétérozygotes. Agronomie 1983b, 3: 67~74

[4]       Colby L W, Peirce L C. Using an isozyme marker to identify doubled haploids from anther culture of Asparagus. HortScience, 1988, 23: 761~763

[5]       Geoffriau E, Denoue D, Rameau C. Assessment of genetic variation among asparagus (Asparagus officinalis L.) populations and cultivars: agromorphological and isozymic data. Euphytica, 1992, 61: 169~179

[6]       González-Castañón M L. Isozyme gene markers in asparagus used to classify fifty asparagus cultivars. Proceedings of the Ninth International Asparagus Symposium, Pasco, Washington, U S A, 1997. Acta Hortic, 1999, 497: 77~84

[7]       Ozaki Y, Tashiro T, Okubo H. Use of allozyme variation for evaluating genetic purity in asparagus (Asparagus officinalis L.) cultivars. The Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 2000, 175 (1): 105~110

[8]       Jiang C X, Sink K C. RAPD and SCAR markers linked to the sex expression locus M in asparagus. Euphytica, 1997, 94 (3): 329~333

[9]       Jiang C, Lewis M E, Sink K C. Combined RAPD and RFLP molecular linkage map of asparagus. Genome, 1997, 40 (1): 69~76

[10]    Reamon-Buttner S M, Schondelmaier J, Jung C. AFLP markers tightly linked to the sex locus in Asparagus officinalis L. Mol Breeding (Netherlands), 1998, 4 (2): 91~98

[11]    Reamon-Buttner S M, Schmidt T, Jung C. AFLPs represent highly repetitive sequences in Asparagus officinalis L. Chromosome Res, 1999, 7 (4): 297~304

[12]    Reamon-Buttner S M, Jung C. AFLP-derived STS markers for the identification of sex in Asparagus officinalis L. Theor Appl Genet, 2000, 100 (3~4): 432~438

[13]    盖昀镒. 试验统计方法. 北京：中国农业出版社, 2000.179

[14]    Rogers S O, Bendich A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol Biol, 1985, 5: 69~76

[15]    Hollingsworth W O, Christie C B, Nichols M A, et al. Detection of variation among and within asparagus hybrids using random amplified DNA (RAPD) markers. New Zeal J Crop & Hortic Sci, 1998, 26 (1): 1~9