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基因库中离体保存甘薯种质遗传稳定性研究
辛淑英 谢 欣 柳哲胜 (中国农业科学院作物品种资源研究所，北京 100081) 郭小丁 唐 君 李玉侠 张允刚 周明德 (徐州甘薯研究中心) (国际植物遗传资源研究所东亚办事处) 摘要 用形态标记、生化标记和蛋白分子标记等三个水平检测国家基因库中离体保存10年的甘薯种质遗传稳定性。结果表明：长期试管保存的甘薯种质，大多数在农艺性状、POD、MDH和叶可溶性蛋白电泳图谱上与其原种基本相同。只有少数品种在EST或α-Amy酶谱出现差异。这就意味着离体保存对甘薯种质的遗传产生影响，并且认为POD、MDH和叶可溶性蛋白电泳图谱不适宜作为鉴定指标；而EST和α-Amy两种同工酶谱可用于检测甘薯离体种质遗传稳定性的生化指标。从22份种质的大田和试管两种生长状态下的生化指标测试结果显示，在这两种生长状态下，遗传稳定的种质，均与原种相同；遗传产生差异的种质，差异均能表达，只是因生长条件不同，酶谱表达方式有别。 关键词 甘薯；试管种质；遗传稳定性；同工酶；可溶性蛋白
20多年来，植物组织培养技术对于作物种质资源的收集、繁殖和保存起着重要的作用。并且显示出其实用价值。因此，世界各国相继建立了无性繁殖作物离体保存基因库。但是，离体试管种质需要经过茎尖分生组织脱毒培养和经常地进行继代繁殖，在外界因子诱导(如激素)和选择压力(如温度、光照、生长抑制剂)的影响下，所保存植株的遗传稳定性可能受到影响，有可能引起植株染色体畸变、点突变和生化变化[1]。随着培养和保存时间的延长，植物材料由于无性变异的增加，存在遗传完整性损失的危险[2]。因此，选择遗传变异最小的保存系统是十分重要的。而且，离体保存的试管种质，其遗传稳定性长期以来也为人们所关注。甘薯是无性繁殖块根作物，遗传上又具高度杂合性，遗传不稳定性的发生机率要比种子繁殖的作物高。所以，有必要对在国家基因库中保存10年的甘薯试管种质进行系统的遗传稳定性检测，为离体试管种质长期安全保存提供科学依据。本研究是从形态标记、生化标记和蛋白分子标记等方面探讨离体保存10年的甘薯种质遗传稳定性。现将研究结果介绍如下。
1 材料与方法 1.1 供试材料 甘薯试管种质选自在国家基因库中保存10年的离体种质[3]。入库时每品种5株系，每株3重复。本试验采用每品种30株试管苗供作遗传分析，共分析22份种质。 1.2 试验方法 按品种来源，选出22个种质(见表1)分别在北京和徐州进行，试材经切段繁殖、盆栽，于当年6月种植到大田，并以原种苗为对照(CK)。种后75～80d，观察其农艺性状，取相应品种的叶片，进行生化指标和叶可溶性蛋白图谱分析。 生化指标检测期分别为试管苗期，种植大田期和部分种质结薯后、第二年由块根发苗种植大田期（75～80d）等3次测定，综合评定。 1.2.1 形态标记 农艺性状鉴定的指标中质量性状有：叶形、叶色、叶脉色、叶柄基色、薯皮色、薯肉色等，数量性状有：基部分枝数、最长蔓长、节间长、茎粗、薯鲜重等。性状描述采用国际马铃薯中心(CIP)和国际植物遗传资源研究所(IPGRI)共同制定的甘薯农艺性状调查描述法。调查数据输入计算机分类分析。1.2.2 生化标记 同工酶电泳是取植株顶端倒数第3～5个叶片为材料，每株取0.15～0.3g叶片，加入4℃预冷的提取液(0.2M tris、4%PVP、20%蔗糖、0.1%巯基乙醇)0.8～1ml，在冰浴中匀浆后倒入1ml离心管，室温下以5000r/min离心5min，上清液为酶粗提取液，备作电泳。采用双垂直板(13cm×21cm)聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。酯酶、过氧化物酶、α-淀粉酶和苹果酸脱氢酶等同工酶的酶液分离按杨太兴方法[4]，上样量为5～30μl。1.2.3 叶可溶性蛋白分子标记 取样法与同工酶电泳相同。每株取0.08g叶片加400μl提取液[5]匀浆，浆液转至Eppendof管，在100℃沸水中变性5min，10000r/min离心10min，上清液为蛋白粗提取液，入冰箱备用。参照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法[6]，略作改动。浓缩胶为5%，分离胶12.5%，上样量为30μl，电泳时先稳流15mA，待样品进入分离胶后，电流调至30mA，电泳约5h。
2 结果 2.1 农艺性状鉴定结果 试验材料于6月中旬种植到大田，种后75～80d进行农艺性状观察和测定，结果见表1(预试6个品种因记载方法不同未列入内)。由于观测时间稍偏早，除陕薯1号、南瑞苕，百年纪念等品种外，其它品种地下部尚未结薯块，故无统计数据。 从表1显示，在供试的甘薯种质中，所有的品种茎缠绕度和叶片大小与原种表现一致，比值为0，说明这两种特性表现稳定。在品种间性状差异变化范围较小的有茎粗、叶形、成叶色和叶柄长度。在供试的品种中，仅番薯香、农林4号、Red chiff 3个品种的叶形和金瓜薯、西薯209、湛59的成叶色呈现差异，其余的品种略有微小变化或表现稳定。性状差异变化范围较大的有茎端茸毛、叶脉色和幼叶色，在17个种质中，有10个发生不同程度的变化。其中叶脉色差异大的种质有金瓜薯、番薯香、农林4号、Red chiff等，幼叶色差异大的种质是红砂薯、金瓜薯、番薯香、烟薯8号，惠薯6号、农林4号。特性特征变化范围最广的是植株类型(70.6 %)、茎色(64.7 %)和茎节长度(64.7 %)。在一般情况下，甘薯地上部形态特征的差异主要表现在叶形、叶脉色、叶柄色和茎色。而植株类型即主蔓长度发生变化比较少。这可能的原因是试管植株移栽受到环境因素影响，需时适应，生长缓慢和植株发育不良等因素的影响造成。 2.2 生化指标棗4种同工酶电泳 从田间采摘第3～5片新鲜幼叶为材料，得到22个种质及其原种的4种同工酶谱比较结果见表2。 2.2.1 过氧化物酶(POD)电泳图谱 甘薯叶片的POD同工酶电泳图谱较丰富，根据酶迁移率不同，从负极至正极出现慢速区(S)，中速区(FS)和快速区(F)。22个参试种质的酶谱与其原种相同，酶带深浅也相近，两者之间没有差异。但不同品种间的酶谱各不相同。2.2.2 苹果酸脱氢酶(MDH)电泳图谱 在参试的22个种质中，大多数种质的MDH同工酶谱只有2条带，仅莒525、566两个品种具有3条带。离体保存10年的甘薯种质，其MDH同工酶谱在谱带数量、位点和强度上均与原种相同。
表 1 甘薯试管种质与原种主要农艺性状比较Table 1 The comparison of main agronomic characters between the plants of in vitro germplasm and their originals of sweet potato (Ipomoes batatas Lam)
2.2.3 酯酶(EST)电泳图谱 甘薯EST酶谱按其迁移率大小，自负极至正极可分为S、FS、F 3个区带。不同甘薯品种之间EST酶谱各不相同，主要表现在F区。在22个品种中，陕薯1号等17个试管种质与原种酶谱相同。但有金瓜薯、西薯209、徐薯18、农林4号和Red chiff等5个种质的EST酶谱与原种在F区出现差异，其中西薯209、徐薯18、金瓜薯分别增加酶带1、2、3条，而农林4号和Red chiff两品种则出现酶带拼合现象，分别由5条带减至4条或者3条。并且在酶带的迁移率和强度上也略有变化。
表 2 甘薯离体种质与其原种的生化指标检测结果比较Table 2 The results of biochemical marker analysis of in vitro stored plants and their originals
(-)表示与原种无差异；(+)表示与原种存在差异 (-) means no difference from protospecies; (+) means difference from protospecies
2.2.4 α-淀粉酶(α-Amy)电泳图谱 甘薯叶片的α-Amy酶谱有2～4条带(Amy1、2、3、4)，绝大多数品种具2～3条，具有4条带的品种有陕薯1号、番薯香和566。在22个供试种质中，有20个品种的α-Amy酶谱与原种相同。仅农大红和Red chiff两个品种比原种植株分别增加Amy2-2，Amy2-3或缺Amy2-1、酶带拉长成条，色浅不清晰，呈现出保存种质与原种之间的α-Amy酶谱的差异。 2.3 叶可溶性蛋白(soluble protein)指纹图谱从甘薯叶可溶性蛋白指纹图谱分析结果表明，22个供试甘薯试管种质与其原种之间的蛋白质图谱没有差异，而且品种间的谱带也相同，显示出近亲关系。其可溶性蛋白谱带均为31条。 3 讨论 关于组织培养物的遗传变异问题，Templeton-Somers等[7]指出，采用分生组织培养的试管苗和茎节苗，其产量和形态特性变化是由繁殖方法的不同引起的差异，而且只要经过一个生长周期，就足以消除这些差异。国际马铃薯中心在研究离体保存马铃薯种质中发现，组织培养会引起表现型的变异，通常是株型、生长习性和薯块皮色等变化。并指出组织培养过程中先形成愈伤组织后再生植株，容易导致基因变异。为探讨试管种质在长期保存过程中的遗传完整性，本试验选用在国家基因库中保存10年的甘薯试管种质，进行农艺性状鉴定，除部分种质因种植晚不结薯外，其它的性状变化与前人报导的结果基本相同。尽管农艺性状是鉴定种质资源的传统方法，但是，单靠形态特征观察来判断种质遗传特性是否发生变异是比较困难的。作者认为要使鉴定工作做得更加完善，应该把形态特征观察与生化指标、分子标记等方法结合起来。 自从1973年由Pierce和Breabaker提出应用同工酶技术鉴定作物栽培种之后[8]，该项技术已广泛地应用到苹果、草莓、菠萝、山茶等无性繁殖作物的无性系鉴定，研究群体内遗传变异和群体间的亲缘关系。用生化标记鉴定作物栽培种提供了比用形态标记更为精确的方法，而且具有专一性[9]。 本试验采用POD、EST、MDH和α-Amy 4种同工酶谱和叶可溶性蛋白图谱检测在基因库中离体保存10年的甘薯试管种质。在22个供试材料中，有陕薯1号、百年纪念等16份种质的4种同工酶谱和叶可溶性蛋白图谱与原种没有差异。22个种质的POD、MDH酶谱和叶可溶性蛋白图谱与原种相同。仅其中的金瓜薯、西薯209、徐薯18、农林4号和Red chiff 5份种质的EST酶谱与原种在F区出现差异；而农大红和Red chiff两份种质的α-Amy酶谱分别增加Amy2-2，Amy2-3或缺Amy2-1、酶带拉长成条，色浅不清晰。综上分析结果表明，保存10年的甘薯试管种质，绝大多数是遗传稳定的，只有少数的品种在EST或α-Amy酶谱出现差异。根据有关文献报导，酶谱作为基因编码的产物，其变化能很好地代表DNA分子的变化，表明等位基因存在位点变化。因此，酶蛋白可以作为基因变异的标记。这就意味着长时间的试管保存对一些种质的遗传稳定性产生影响。并且认为POD，MDH和叶可溶性蛋白图谱不适宜作为离体保存甘薯种质遗传稳定性鉴定指标。EST和α-Amy两种同工酶谱可作为甘薯离体种质遗传稳定性检测的生化指标。 从22份种质的大田种植材料(试管苗→大田→块根发芽→大田)和试管苗两种生长状态下3次测试结果比较，可以发现，除品种莒525的EST酶谱表现不同外，其它表现稳定的种质，在上述两种生长状态下，5种生化指标均与原种相同。而大田材料检测出现EST或α-Amy酶谱与原种产生差异的种质，在试管苗生长状态下也已表现出差异，只是因生长条件不同，其酶谱表现形式有别而已。因此，我们认为甘薯离体种质的遗传检测，可直接在试管生长状态下，用EST和α-Amy两种同工酶谱为指标加以测试，这样可省时省力省费用。 参考文献 1 Withers L A.In plant tissue culture and its agricultural application.in:L.A Withers,P.G.Amerson ed.Butterworths.London,1986,261～276 2 Scowcroft W R.Genetic variability in tissue culture:Impact on germplasm conservation and utilization,IBPGR,Rome,Italy.1984 3 辛淑英.甘薯(Ipomoea batatas Lam)种质保存技术和条件.见:马缘生主编.作物种质资源保存技术研究论文集.北京：学术书刊出版社.1989，2～9 4 杨太兴,李继耕,曾孟潜.玉米不同细胞质雄性不育类型的同工酶分析.作物学报.1982，8(4)：270～276 5 郑晓峰,黄百渠.几种植物体细胞胚胎发生标记蛋白的研究.植物学报.1994，36(3)：175～180 6 周顺伍.生物化学试验技术.北京：北京农业大学出版社.1991，97～107 7 Templeton-Somers K M,W W Collins.Field performance and clonal variability in sweet potatoes propagated in vitro,J.Amer.Soc.Hort.Sci.1986,111:689～694 8 Pierce L C,J Brewbaker.Applications of isozyme analysis in horticultural science. Hortscience 1973,8:17～22 9 Moore G A,G B Collins. New challenges confronting plant breeders.In: S.D.Tanksley,T.J.Orton ed. Isozymes in plant genetic and breeding, part A.Elsevier,Amsterdom.1983,25～51
Studies on genetic stability of sweet potato germplasm maintained in In Vitro Genebank
XIN Shuying XIE Xin LIU Zhesheng (Institute of Crop Germplasm Resources, CAAS.Beijing 100081) GUO Xiaoding TANG Jun LI Yuxia ZHANG Yungang (Xuzhou Sweet Potato Resources Center) ZHOU Mingde (IPGRI for East Asia Office)
Abstract Three mark methods, morphological characterization, enzymes lectrophoretogams and leaf soluble protein fingerprinting were used to analyse genetic stability of sweet potato germplasm maintained in vitro for 10 years at the National Genebank. The results showed that most agronomic characters, POD, MDH and soluble protein eletrophoretogram of sweet potato germplasm stored in vitro for a long term were basically the same as their originals varieties. The differences were only detected in EST and α-Amy isozyme zymograms in exceptional plants of some varieties. That means long-term in vitro storage will affect the genetic stability of sweet potato germplasm. Thus, it is considered that POD, MDH, and soluble protein electrophoretograms could not be used as biochemical markers in genetic stability analysis of sweet potato germplasm maintained in vitro, but EST and α-Amy could.The result of the biochemical analysis of the plants in the field and stored in vitro showed that there are no genetic variances between protospecies and the cultivars that showed genetic stability in the two different growth conditions. The result also showed that variances can be detected, but isozyme zymograms were different in the two different growth conditions. Key words Sweet potato;In vitro germplasm;Genetic stability;Isozymes;Soluble protein
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