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中国大豆资源脂肪氧化酶缺失类型研究
傅翠真 常汝镇 徐文英 (中国农业科学院作物品种资源研究所，北京 100081)
摘要 作者利用改进的IEF-PAGE电泳方法，对中国26个省(自治区)的1726份栽培大豆资源(包括南方多作区资源1611份、黄淮海夏作区资源62份，北方春作区资源53份)进行了脂肪氧化酶(Lox)缺失类型鉴定，并研究了Lox缺失与种植区域、播种期类型及籽粒颜色的关系。结果表明：在中国大豆资源中发现了4种Lox缺失类型，共99份Lox缺失突变体，占鉴定资源总数的5.73%，其中80份缺失Lox-3，12份缺失Lox-2，6份缺失Lox-2.3及1份缺失Lox-1，这些缺失体主要分布在南方多作大豆区(97份)和黄淮海夏作大豆区(2份)；缺失频率较高的有四川(Lox缺失体占本省鉴定资源数的9.77%)、贵州(7.09%)、浙江(6.86%)等省。筛选出的99份Lox缺失材料中，夏播大豆65份，春播大豆33份，秋播大豆1份；黄种皮大豆64份、绿种皮大豆15份、黑种皮大豆10份、褐种皮大豆9份、双色种皮大豆1份。关键词 大豆；脂肪氧化酶缺失体；IEF-PAGE
大豆种子中含有的脂肪氧化酶，能促使不饱和脂肪酸氧化、分解形成小分子的醛、醇、酮等挥发性物质，产生豆腥味和苦涩味。因此在加工过程中要尽可能降低或去除脂肪氧化酶活性，通过加热处理、微波照射、有机溶剂萃取等方法减少豆腥味，这些措施不但使加工成本增加，而且还经常引起大豆蛋白溶解度下降。利用脂肪氧化酶缺失的大豆种质，可有效地解决豆腥味难题。 Hildebrand和Hymowitz(1981)通过测定酶活性，从6000份材料中筛选出2份Lox-1的自然突变缺失体；Kitamura等(1983)用改进的PAGE电泳法，分析5000份材料，鉴定出Lox-2和Lox-3自然突变缺失体；Davis和Nielsen(1986)通过遗传分析表明，三种同工酶缺失体分别由隐性单基因控制(lx1，lx2，lx3)，其中lx1与lx2紧密连锁，而与lx3相对独立遗传。 大豆原产于中国，栽培历史悠久，种植区域广阔。由于中国地域大、生态环境复杂，耕作制度多样，在不同地区形成了具有不同特点的大豆品种，多种多样的大豆种质中蕴含有不同特点的珍贵资源，其中存在缺失脂肪氧化酶种质的可能性极大。 傅翠真等用53份中国大豆资源为材料进行大豆脂肪氧化酶凝胶电泳分析研究时，鉴定出缺失Lox-3的材料[1]。随后，用改进的IEF电泳制胶和酶染色技术，对26个省(自治区)的844份中国大豆资源进行鉴定，发现了三种单缺失和一种双缺失的脂肪氧化酶缺失类型[2]，可见，中国大豆种质中的Lox缺失类型极为丰富。为了进一步明确中国大豆种质资源中脂肪氧化酶缺失类型的特点及分布，本研究以1726份中国大豆资源为试材，利用改进的IEF电泳方法分析脂肪氧化酶同工酶，以期筛选出缺失类型，提供育种利用，又可为大豆加工提供优质原料。 1 材料与方法 1.1 材料 征集26个省(自治区)栽培大豆1726份，其中南方多作制大豆区1611份、黄淮海夏作大豆区62份、北方春大豆区53份。考虑到耕作制及食用方式等地域特点，采用选择与随机相结合的取样方式。以美国Century品种等位基因系为缺失体对照；科丰6号为中国品种对照。 1.2 方法 等电聚焦电泳法(IEF-PAGE)样品制备：15mg豆粉加入0.2ml 0.05mol/L Tris CaCl2-HCl(pH8)缓冲液，振荡均匀，放置4℃下提取2h，冷冻离心20min(12000r/min)，取上清液备用。 IEF凝胶：使用聚丙烯酰胺凝胶13.6%胶溶液(29.1%Acr+0.9%Bis)，4.0%Ampholine(pH4~8)，2%Aps和0.073%TEMED。用普通玻璃板(26cm×8cm×0.2cm)代替进口支持膜制胶板，称为玻璃胶板(上层板)，为使凝胶粘贴在上层板上，预先在玻璃板上涂布约2ml 0.1%Bind-silane涂料；下层板厚5mm，两边分别贴有隔条(宽9mm，厚0.5mm)，为不使凝胶附着在下层板上，预先均匀涂布约2ml Repe-silane试剂，凝胶溶液倒在上下层玻璃板之间的空隙中，凝胶规格为25cm×6cm×0.5mm。 IEF电泳和显色：采用LKB Eps3500型电泳仪。将样品提取液直接加在凝胶玻璃板上，一次可加样40～44个，电泳时间约1h50min。 酶染液的配置：染料及反应底物在混合前分别溶解，40mg邻联茴香胺用无水乙醇溶解，200μl亚油酸用无水乙醇溶解后再加1ml吐温20，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6～7.8)定容至200ml。酶染1h后再进行15min考马斯亮蓝蛋白质染色。每个样品重复3次(3块凝胶板)，Lox异型材料重复鉴定5～10次。
2 结果与分析 2.1 大豆种子脂肪氧化酶电泳图谱分析 本实验条件下，中国大豆种子Lox有4种电泳类型：Lox-1、Lox-2、Lox-3a和Lox-3b(图1)，这与Hildebrand(1991)等[3]的报道相符；并发现中国大豆资源中有缺失Lox-1、缺失Lox-2、缺失Lox-2.3及缺失Lox-3的珍贵材料，共鉴定出99份Lox缺失突变体，占鉴定资源总数的5.73%，其中缺失Lox-3的材料80份、缺失Lox-2的12份、缺失Lox-2.3的6份及缺失Lox-1的1份。在电泳图谱上可以看出，缺失Lox-2及缺失Lox2.3时，出现Lox-1带向正极方向迁移的现象。 2.2 大豆种子Lox缺失与类型的分布及特点 不同种植区大豆种子Lox缺失材料分布频率存在差异。南方多作制大豆区鉴定的资源1611份，在9个省(区)中发现Lox缺失体97份，Lox缺失频率较高的有四川(Lox缺失体占本省鉴定资源数的9.77%)、贵州(7.09%)、浙江(6.86%)等省；黄淮海夏作大豆区鉴定62份，发现2份Lox缺失突变体；北方春作大豆区鉴定53份，因鉴定数量有限，目前尚未发现Lox缺失材料。 筛选出的99份Lox缺失材料中，夏播大豆65份，春播大豆33份，秋播大豆1份；其中黄大豆64份、绿大豆15份、黑大豆10份，褐大豆9份、双色大豆1份。 对不同生态条件下大豆Lox缺失频率的研究，有利于发掘大豆多样性种质。
表 1 南方各省大豆种子Lox缺失体分布频率 Table 1 The distribution frequency of lipoxygenase mutants in soybean germplasmresources from South China
3 讨论 3.1 南方多作制大豆区Lox变异类型丰富，这可能与长期自然和人工选择有关。浙江、江苏等省喜食青荚毛豆，形成大粒、易煮、风味好的菜用大豆类型；西南地区地形地貌复杂，地势高低差异悬殊，气候更是复杂多样，大豆分布广泛，在海拔137～2400m的地方均有种植，四川省大豆种质资源分布的最高海拔达到2800m，多种生态环境交错，加上长期交通不便，致使类型丰富的大豆种质资源得以保存下来。3.2 缺失Lox-3材料的电泳图谱在Lox-3b酶带位置上完全空白，而缺失Lox-2材料的电泳图谱在Lox-2酶带位置上，往往出现颜色较淡的带痕，这可能是因为它们的缺失机制不同造成的。缺失Lox-2是由于基因转录过程中编码序列的一个碱基胸腺嘧啶(T)转变为腺嘌呤(A)所造成的，使氨基酸序列中532位上的组氨酸(His-532)被谷氨酰胺(Glu)所替代，只导致Lox-2活性的丧失，但未打破Lox-2的合成[4]，这也许是缺失Lox-2材料的图谱中仍留有带痕的原因；Wang[5]等人报道了Lox-3的缺失机理，即编码该缺失体的基因的5′端调控区域有几个碱基突变，阻断其mRNA的转录，导致Lox-3同工酶的缺失。中国大豆资源中Lox缺失的分子基础尚需深入研究。
参考文献 1 傅翠真，丁安林，常汝镇，等.大豆脂肪氧化酶凝胶电泳分析研究.中国粮油学报.1993，8(4)：36～402 傅翠真，徐文英，苏震.中国大豆脂肪氧化酶缺失种质多样性鉴定研究.中国农业科学.1997，30(1)：44～51 3 Hildebrand D F，Versluys R T，Collins G B.Changes in lipoxygenase isozyme levels during soybean embryo development.Plant Science.1991,75:1～8 4 Wang Wanheng,Tetsuo Takano,Daisuke Shibata,et al.Molecular basis of a null mutation in soybean lipoxygenase 2:Substitution of glutamine for an ironligand histidine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1994,91:5828～5832 5 Wang Wanheng,Tomohiko Kato,Tetsuo Takano et al.Two single-base substitutiions involved in altering in a paired-box of AAATAC in the promoter region of soybean lipoxygenase L-3 gene inpair the promoter function in tobacco cells.Plant Science,1995,109:67～73
Identification of lipoxygenase lacking mutants of seeds in Chinese soybean germplasm
FU Cuizhen CHANG Ruzhen XU Wenying (Institute of Crop Germplasm Resources,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081)
Abstract The mutants of null lipoxygenase (Lox)were identified using modified IEF-PAGE electrophoresis method in 1726 soybean accessions from 26 provinces in China.Its relationship with some factors such as cultivation regions,sowing types and seed coat color was also analyzed.Among those soybean germplasm,99 mutants can be classified into 4 types of lacking one or more Lox isozyme,taking about 5.73% of the total accessions identified.Eighty of which lacked Lox3,12 for lacking Lox2,6 for lacking Lox2,3 and 1 with lacking Lox1.From the cultivation region point of view,1611 accessions came from southern multiple sowing soybean region,97 Lox lacking mutants were found in 9 provinces.Mutants frequency of lacking Lox was relatively higher in some provinces such as Sichuan(9.77%),Guizhou(7.09%)and Zhejiang(6.86%).Only 2 mutants of lacking Lox were identified from 62 accessions in Huang Huai Hai summer sowing soybean region.However,none mutant has been found from 53 accessions in northern spring sowing soybean region,it may be due to the identification of limited accessions. Among 99 Lox lacking mutants,there are 65 summer sowing accessions,33 and 1 for spring sowing and autumn sowing accessions ,respectively;64 accessions with yellow seed coat,15 with green seed coat,10 with black seed coat,9 with brown seed coat and one with bicolor seed coat.In addition,a rapid and simple method has been developed for identification of lipoxygenase lacking mutants in soybean seeds. Key words IEF-PAGE；Lipoxygenase lacking mutants;Soybean
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