低温库种质安全保存理论的研究进展

卢新雄 陈晓玲 陈叔平

种质安全保存的含义可理解为：通过采取有效的保存技术，最大限度地减少种质在贮藏和更新过程中发生遗传漂移，以维持每份种质的遗传完整性。低温种质库是保护种子体植物种质资源的最佳途径。世界上已收集到的610万份植物种质资源，约90%是以种子体形式保存于上千座低温库中^［1］。至1999年，我国国家长期库也已贮存32万份种质，贮存数量居世界各种质库首位。但是，种质在低温库中贮藏，并不是万事大吉。一些种子贮藏不到15年，其发芽率就下降至10%以下^［2］。有报道称，原贮存样品经更新后，多达50%的原种质样品已丧失^［3］。因此，很有必要对低温库种质安全保存理论作一系统阐述，以便有目的地开展相关研究，来确保种质长期安全保存。

P=（K_i-V）10^{KE-CWlog10m-CHt-CQt2}

上述通则和寿命公式在实践应用中可能不是很精确，但它揭示了种子寿命与种子贮藏温度和种子含水量的相互关系。FAO/IPGRI正是基于上述理论基础，提出了种质中长期贮藏的技术标准：中期贮藏温度为0~10℃，种子含水量为5%~8%；长期贮藏温度为－18℃，种子含水量5%~7%，大豆8%^［4］。种子含水量干燥到5%~8%，此时种子内基本上不含自由水，大多数的酶活性处于钝化状态，生化反应不能或者很缓慢地进行。加上是低温条件，则呼吸作用也非常微弱，甚至不能形成偶联呼吸，可以说新陈代谢几乎处于停止状态。因此，通过改善种子贮藏环境，可大大延长种子贮藏寿命而达到长期保存的目的。

不同物种的种子，其贮藏寿命由种子本身的遗传因子所决定，可分为短寿命、中寿命和长寿命三种类型。对于品种之间，种子生活力丧失差异也非常大。1996~1998年期间，作者对国家库的14种作物1.5万份贮存种子（贮存10年以上）进行了生活力监测，发现其中80份材料的发芽率明显下降（从85%以上降到70%以下）。德国Gatersleben基因库在对12种作物30500份样品（贮存2~15年）进行的生活力监测中，也发现生活力丧失差异非常大，有的甚至降到10%以下［2］。另外，种子休眠、硬实种子、种子大小及种子的构造和成份等对种子耐贮藏性也有重要影响。

从繁种到入库贮存，种子质量可能受到几方面的影响：种子成熟和收获时期的恶劣气候及其它不良环境因素；收获后的干燥、脱粒及运输等环节导致种子损伤；入库前处理，如临时存放、加温干燥或发芽检测不妥等。上述因素有的虽然一时看不出对种子生活力的影响，但很可能是种子活力下降的潜在影响因素^［5］。

2.1 种子贮藏过程中生活力丧失特性

在目前生活力检测条件下，个体种子寿命不能直接测出。然而，通过对同一样品贮藏过程中的一系列发芽试验来测定种子寿命，可推测出这一群体个体寿命状况，依据测定结果所绘出的曲线称之为种子生活力存活曲线。Harrington(1963)经过大量观察和验证，指出种子在任一恒定贮藏条件下，种子活力及生活力下降的曲线呈反S型。Chang花了23年时间，对贮存于低温库（温度2℃）的3个水稻品种每隔1~2年进行一次发芽测定^［6］，结果表明低温下种子生活力丧失曲线也表现为反S型。从种子存活曲线可以看出：（1）种子活力和生活力丧失不是以等速率下降；（2）生活力及活力均有急剧下降阶段，而活力下降先于生活力下降。因此，深入了解种子活力和生活力的丧失特性，对制定低温库生活力监测方案和发芽率更新标准具有重要指导意义^［7］。

2.2 种子生活力丧失的机理

种子在生理成熟时，其活力达到最高点。之后，随着贮藏时间的延长，种子逐渐老化，最终丧失发芽能力。种子老化的过程是渐进式的，而且是有次序的，通常是先产生生物化学变化，然后再产生生理变化。陶嘉龄和郑光华在总结前人研究的基础上，提出种子生活力丧失机理可分为2个阶段，即生化劣变和生理劣变^［8］。生化劣变表现为膜系统受损，膜的结构与功能的改变，渗漏增加；酶活性下降，如脱氢酶活性的下降；高能量化合物合成速度下降；呼吸速率下降，耗氧量减少；蛋白质及RNA合成速率下降；染色体及DNA受损，突变增加；生理劣变表现为种子耐贮力下降，萌发及生长减缓，萌发整齐度下降，抗逆境能力下降，出苗率降低，不正常幼苗增加，种子失去发芽能力。但应特别强调指出，种子老化导致种子生活力的下降以至生命力的丧失，其机理是相当复杂的。种子活力下降及生活力丧失的机制可概括为两方面，一是外因的直接作用或间接影响，二是种子内部的演变过程，二者密切关联，外界因素实为内部变化的诱发因子和条件［9］。近来研究表明，对于基因库贮存种质的老化，膜的脂类自动氧化，产生挥发性醛类物质并导致有毒物质累积占主导地位^{［10，11］}。

3.1 染色体畸变

染色体畸变发生原因至今还未研究清楚，但有关染色体畸变已得出如下结论：①染色体畸变在种子衰老过程中是一种普遍现象，它是种子老化作用的结果，而不是贮藏时间长短的结果；②染色体畸变率与种子发芽率之间存在着高度的负相关性；③在种植生长和繁殖过程中，含有畸变的大部分细胞在分生组织的细胞分裂过程中，通过二倍体选择而被淘汰。这是因为畸变细胞中染色体缺失或遗传不平衡，而导致不能适当地起作用，结果它们在分生组织中的作用迅速被其他正常细胞所取代。因此，染色体畸变是不能传给下一代的。从这方面看，染色体畸变似乎对种质保存没产生不利的后果。但是，种子老化诱导染色体畸变的同时，很有可能也诱导了点突变^［15］。

3.2 基因突变

种质贮藏期间发生另一类型的遗传变化是点突变。由于点突变大部分是隐性基因的突变，只能通过后代来观察测定。早期鉴定老化种子诱导点突变的是花粉生活力和叶绿素突变测定。由于点突变大多是隐性的，加上突变频率又很低，这样需要观察大量群体来建立环境因素和点突变诱导数目之间的数量关系模式，因而难于进行实践研究。因此，有关基因突变（如点突变）与发芽率关系也很少引起人们的重视。当然，大多数突变是有害的，而这些有害突变通常在选择压力下很快从群体中消失，如叶绿素缺陷突变体。在研究种子老化诱导其他类型突变方面，例如，影响生理和生长的大多数突变是无法测定的，因许多突变具有数量效应。但是，Purkar等人的研究结果至少表明，豌豆多基因可遗传数量性状变化与种子生活力丧失有关，即老化种子影响到作用于生长效应的修饰基因，尽管修饰基因的突变虽然一时没有表现出显著效应，但它可能是种子老化永久的产物。因此，这种基因突变对种质的潜在影响应引起重视^［15］。

3.3 遗传选择

遗传上异质种质在贮藏过程中，不仅与同质遗传材料一样遭受遗传变化的诱导，还遭受遗传选择。影响遗传选择有两种机制，第一是不同物种甚至是同一物种内不同品种间或个体间，都存在寿命差异（存活差异）。物种或物种内不同个体间的存活差异是不易确定的。但依据生活力方程V=Ki－P/σ，物种基因型和贮藏前的环境条件（如病虫害或其他逆境条件）决定Ki值，即决定着种子的潜在寿命。第二是种子寿命除直接受基因型控制外，其他一些遗传上受基因控制的性状，在一定程度上也间接影响到种子潜在寿命。例如，母株上种子生理成熟后的推迟收获，很明显影响到后来贮藏期间的种子衰老，即在数量上可表示Ki值已下降。因此，如果一份种质材料，是从大量不同基因型的田间样品中收集，其样品成熟在不同时间，但收获在同一日期。这样即使它们贮藏潜力没有存在本质上的遗传差异，但依据Ki 值，则存活寿命已存在长短差异，这是一种间接的遗传效应。

直接和间接影响寿命的不同基因型混合组成的种质材料，总体存活曲线可通过组成基因型的相对数量和通过它们个体存活曲线来测定，该曲线即在时间上依次成比例表现出相关的直接和间接遗传影响效应。Roos用种子壳色和荚果颜色不同的8个菜豆品种混合成一个群体，来研究预测种子重复老化和更新周期对混合群体不同组分的影响。结果表明，在种子老化和更新过程中存在着遗传选择，混合群体中发生了遗传漂移，遗传变异性显著减少。经过15次种子老化和更新周期，其中的6个品种几乎从这一混合体中丧失^{［16，17］}。

遗传漂移并不总是通过表现型或数量性状表现出来。因而，有些学者开始从分子遗传水平上来研究种质样品的遗传漂移。Stoyanova根据醇溶蛋白的酶谱差异，研究种子老化诱导的遗传漂移。某小麦种质含有A、B、C、D 4种类型的纯系群，经老化处理后，即当发芽率下降到30%以下，仅个别D型和大部分B型纯系群植株存活，而C型和A型纯系群已消失^［18］

。该结果表明，随着种子生活力下降，该份种质发生了遗传漂移。因此，对于种质库管理者，不但要防止由于种子老化而引起种质发生显著的遗传变化，更要防止遗传上异质群体的遗传变异性丧失。因为遗传选择导致遗传变异性的丧失比其他的遗传变化所产生的问题来得严重^［19］。

综上所述，种质贮存于现代化低温库中，仅能大大延长其贮藏寿命，其种子老化仍在缓慢发生，并最终诱导了种质的遗传变化。但由于种子老化和遗传变化的发生机制仍不清楚，物种及品种间存在寿命差异以及贮藏前所受伤害的不可预见性等因素，使得种质库贮存几十万份种质的活力和遗传完整性难以控制和预测。因此，低温库贮存种质安全性应引起重视，尤其是随着贮存时间延长和贮存数量的剧增，该问题将更加突出并令人担忧。为此，开展并加强低温库贮存种质安全保存理论研究尤为迫切。

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Advances on theory of the safe conservation for germplasm

in seed Genebank

LU Xinxiong CHEN Xiaoling CHEN Shuping

(Institute of Crop Germplasm Resources,Chineses Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081)