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用组织培养法繁殖疣粒野生稻研究
秦发兰 陈葆棠 林兴华 朱永生 张端品 章荣德 (华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070)
摘要 疣粒野生稻是优异的种质资源，由于其种子的强休眠性，常规方法很难繁殖成功，本实验利用组织培养方法，通过诱导试管苗和诱导愈伤再分化成苗两种途径，对疣粒野生稻的试管微繁进行了研究，获得了一定数量的疣粒野生稻试管苗及成熟种子。本文研究结果表明，疣粒野生稻直接成苗及愈伤分化成苗对培养基的选择性均不强，用组织培养法快速繁殖疣粒野生稻是行之有效的途径。 关键词 疣粒野生稻；稻种资源；组织培养
国内外统计资料表明，提高粮食单产的根本途径在于品种改良，而突破性品种育成的关键在于优异种质的成功利用。野生种常常是抗病虫性、抗逆性、优良品质、丰产性和细胞质雄性不育的基因来源［1］。我国现有普通野生稻（O. rufipogon）、药用野生稻(O. officinalis)和疣粒野生稻(O. meyeriana)三种野生稻资源。由于人类的活动，许多原来适于野生稻生长的环境已遭到破坏，野生稻资源已临近濒危［2］，我国三种野生稻已被定为二级保护濒危物种［3］。疣粒野生稻对白叶枯病高抗或接近免疫，高抗细菌性条斑病和褐稻虱，同时抗稻瘟病、螟虫［2,4］，是一种优异的种质资源。而对疣粒野生稻的详细研究还比较欠缺，直到1997年，Aggarwal［5］根据基因组总DNA杂交后聚类分析研究，才将疣粒野生稻复合体命名为GG染色体组型。疣粒野生稻种子休眠性强，用常规方法很难繁殖成功，因而不便于育种和遗传利用研究。加快繁殖与保存优异野生稻种质资源具有重要的理论与实践意义。 本文利用组织培养的方法，对疣粒野生稻的快速繁殖作了一些初步研究。
1 材料与方法 1.1 野生稻收集及处理 本课题组于1996年11月底赴云南省景洪县采集野生稻资源。野生稻原来生长环境已被开发成成片的橡树林。只在没有开采的山麓下的野草中采集到一些疣粒野生稻种子和植株。将植株连同带回的土一起移栽到盆钵中，由于生长不良，进行分蔸处理，并用从竹林中和树林中取回的土混合作底土栽培。每天喷洒一些水以保持湿润并注意遮荫。组织培养出来的小植株也用同样的方法栽培。 利用采回的疣粒野生稻种子进行组织培养。以成熟的或未成熟的疣粒野生稻种子作为外植体诱导成苗或诱导愈伤。种子去掉颖壳后，用70%乙醇表面消毒1min，然后用0.1%的升汞（HgCl2）消毒10～15min，接种于培养基。 1.2 培养基 诱导成苗培养基：NB培养基［6,7］，即N6培养基的大量元素+B5培养基的微量元素和有机成分；MS培养基。 诱导愈伤培养基：NB2、NB4、MS2(这里的2，4分别指所用2,4-D的浓度分别为2mg/l和4mg/l，以下相同)。 愈伤继代培养基Ⅰ：NBP2即NB2+0.1%PG（PG为本室研究人员陈葆棠博士研制的一种植物抗衰老剂［8］）。愈伤继代培养基Ⅱ：NB2+0.1%PG+0.2 mg/lKT。 分化培养基：NBK：NB+0.5mg/lIAA+1～2mg/lKT；MSK2：MS+2 mg/lKT。 繁苗培养基Ⅰ： MS+1 mg/l6-BA；繁苗培养基Ⅱ：1/2MS+1 mg/l6 BA+0.1 mg/lIBA。 上述培养基均含3%的蔗糖、0.6%的琼脂，pH为5.8。
2 结果与分析 2.1 种子直接繁殖试管苗 由于种子量少，试验只采用20粒种子。将除去颖壳消毒过的种子接种于NB培养基和MS培养基，每管3粒。6d后即观察到1粒种子已长出胚芽，10d后观察到3粒种子发芽，接种的种子有的陆续发出小芽，有的始终不能发芽。将长出的小芽转移到繁苗培养基Ⅰ中，小苗表现出根系生长不良，一段时间后，将小苗转到繁苗培养基Ⅱ上，小苗在这种培养基上很快长出新根，且根粗、根长、分蘖势强，有的一根小苗经过分蘖可以被分至10株。我们对这批试管苗分别进行编号，经过炼苗后移栽于盆钵中，经过细心的管理，大多数都能正常成活且正常结实，我们已收获了一些种子。 由此可以看出，用组织培养的方法繁殖疣粒野生稻是一种有效的方法。所用培养基的大量元素、微量元素、有机元素等对诱导成苗的影响不大，6-BA有利于分蘖，而IBA的存在则有利于根的分化。 2.2 诱导愈伤、分化成苗 2.2.1 诱导愈伤 将去除颖壳、经过消毒的种子接种到诱导培养基上。
表1 冬夏季不同培养基诱导疣粒野生稻愈伤 Table 1 Calli induced on different media in winter and summer
试验如表1所示，分别在冬季与次年的夏季进行。冬季试验所用培养基为NB2和NB4，在NB2培养基上1个月出现1粒愈伤，在NB4培养基上在2个月出现愈伤；夏季试验所用培养基为NB2和MS2，在NB2和MS2上各接种了7粒，NB2培养基上在接种后8d出现1粒愈伤，18d后有4粒种子出现愈伤，2粒种子长出小苗，接种在MS2诱导培养基上的种子，在8d出现1粒愈伤后不再有愈伤出现。由以上结果看出，疣粒野生稻诱导出愈伤是完全可行的。冬季试验两种处理所用培养基完全一样，季节也相同，由于2,4-D浓度不同，导致出愈时间和种子出愈数不一样，4mg/l的浓度对于诱导疣粒野生稻愈伤来说可能是高了一些。夏季试验在接种后8d就出现了愈伤，疣粒野生稻较强的种子休眠性到次年夏季时较易于打破，因此，更容易诱导出愈伤，疣粒野生稻诱导出愈伤的迟早可能与种子的接种季节、种子休眠性以及2,4-D的浓度等有关，NB培养基用作疣粒野生稻的诱导培养基更适合。 本文主要以冬季试验的结果来描述愈伤进一步继代及分化成苗的情况。 当小愈伤长至0.2cm时，切除胚乳部分，将愈伤转到继代培养基NBP2中进行培养，小愈伤生长迅速，很快增殖至1cm大小，在12d后将增殖的愈伤进行扩大培养。愈伤组织生长旺盛，愈伤组织质量或状态非常好，呈金黄色颗粒状。每隔15至20d继代一次。几次继代后，愈伤组织出现发粘现象，植物抗衰老剂PA有阻止愈伤变褐的作用，却无法阻止其发粘，后在培养基中添加0.2mg/l的KT，发粘现象有所缓解。田文忠［7］也提到KT可以改进愈伤组织的质量，而1mg/l的KT会使愈伤褐化。在继代培养基中添加KT浓度的大小还有待进一步研究2.2.2 愈伤分化出苗 以冬季诱导出的第一粒愈伤进行分化成苗研究。
表2 愈伤分化成苗 Table 2 Plantlets differentiated from calli
基Ⅰ中生长还快，不发粘，但出现褐化现象。在生长半个月后，将愈伤一部分重新转到继代培养基Ⅱ中，愈伤组织质量得到改善；一部分进行分化继代，培养基中的KT浓度增加到2mg/l，在这种培养基上生长的愈伤组织出现严重褐化 ，但在褐化愈伤内部却长出新愈伤，部分长出绿点和白根， 50d后出现2株小绿苗。将新长出的愈伤再继代到NBK2上，这些愈伤继续增殖并分化出绿苗，当愈伤长至一定大时，或营养快消耗完时，再进行分化继代。在NBK2培养基上的愈伤最多一管可分化出15株绿苗。 将愈伤转到NBK2的同时也将部分愈伤转到MSK2上，经过约2个月后也分化出相当数量的绿苗和极少的白化苗，说明疣粒野生稻愈伤分化培养对培养基的选择性不强。 愈伤分化出的小苗根系一般都很好， 将小苗直接转到繁苗培养基Ⅰ上。在繁苗培养基Ⅰ上经过一至几次继代后，有的可以直接炼苗移栽到盆钵中，分蘖多的就进行分蔸繁殖。 经统计，由1粒疣粒野生稻种子诱导的愈伤，在10个月后可以分化出近200株的绿苗。由于同时还在进行其它试验，每次继代的管数不可能太多，如果扩大范围，分化出的绿苗数将会更多。
3 讨论 3.1 组织培养法繁殖野生稻 野生稻有其特有的生态型，种子发芽所需条件与其种性有极为密切的关系，疣粒野生稻比AA、CC、BBCC、CCDD、EE、FF染色体组种的材料发芽困难，我们自己也进行了疣粒野生稻发芽试验，没有成功。所以选择组织培养法，通过直接诱导试管苗和先诱导愈伤再分化出苗两种途径来繁殖疣粒野生稻以供进一步研究是非常有用的。同时，由于野生稻的种子成熟度不一致，表现在诱导成苗时，不同种子之间成苗的时间拉得长。另外，诱导出的愈伤在分化培养基上表现出严重的褐化现象，对此，我的体会是要有足够的耐心，因为这些愈伤最终分化出了大量的绿苗。在野生稻资源遭到严重破坏的情况下，用组织培养法快速繁殖疣粒野生稻是行之有效的途径。 3.2 试管苗进一步利用 野生稻长期处于自然环境，形成了自身的一些特点，有些野生稻如药用野生稻、疣粒野生稻柱头外露，异交率高，导致野生稻的遗传基础复杂，不同植株之间、每一株上的种子其遗传基础都可能不同，使一些重要研究由于材料的限制而受到限制，而通过组织培养方法可以由同一粒种子培育出大量植株，因此，可以获得大量的具有相同遗传基础的材料，这些材料对于遗传和育种的进一步研究是非常有用的。
参考文献 1 蔡旭主编.植物遗传育种学（第二版）.北京：科学出版社.1988. 301～325 2 高立志，张寿洲，周毅，等. 中国野生稻的濒危现状调查. 生物多样性.1996，4（3）：160～166 3 傅立国主编.中国植物红皮书.北京：科学出版社.1991， 314～316 4 应存山主编.中国稻种资源.北京：中国农业科学技术出版社.1993， 17～28 5 Aggarwarl R K, Brar D S， Khush G S.Two new genomes in the Oryza complex identified on the basis of molecular divergence analysis using total genomic DNA hybridization. Mol Gen Genet. 1997, 254:1～12 6 吴传银，陈英. 粳稻花药培养基因型差异的研究.遗传学报.1987，14（3）：168～1747 田文忠，Iann Rance, Elunialai Sivamani, 等.提高籼稻愈伤组织再生频率的研究.遗传学报.1994, 21（3）：215～221 8 陈葆棠，谢岳峰，张端品，等. 植酸在水稻（Oryza Sativa L. ）细胞培养中的促进作用.实验生物学报.1996，29（4）：231～236
Studies on Oryza meyeriana (Zoll. et Merr.) Ball. resources by tissue culture
QIN Falan CHEN Baotang LIN Xinghua ZHU Yongsheng ZHANG Duanpin ZHANG Rongde (National key lab of crop genetic improvement Hua Zhong Agricultural University, Wuhan, 430070)
Abstract Oryza meyeriana (Zoll. et Merr.) Ball. is very difficult to be propagated successfully by conventional methods because of its deeplydormancy. By inducing tube plantlets and calli and then differentiating plantlets, we have obtained some plantets and seeds of O. meyeriana. The results indicated that, the media does not affect strongly the efficiency of plant regeneration of direct germination of the embryos and plant regeneration from calli, and tissue culture is one of efficient approaches to propagating O. meyeriana B. Key words O. meyeriana; Germplasm resources; Tissue culture
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